Érika Monteiro MichalskyI; Karla de Sena GuedesI; Fabiana de Oliveira Lara e SilvaI; João Carlos França-SilvaII; Consuelo Latorre Fortes DiasIII; Ricardo Andrade BarataIV; Edelberto Santos DiasI
ILaboratório de Leishmanioses, Centro de Pesquisas René Rachou, Fundação Oswaldo Cruz,Belo Horizonte, MG IIDepartamento de Parasitologia, Laboratório de Leishmanioses e Vacinas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG IIIDiretoria de Pesquisa e Desenvolvimento, Serviço de Biologia Molecular I, Fundação Ezequiel Dias, Belo Horizonte, MG IVDepartamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, Diamantina, MG
RESUMO
INTRODUÇÃO: A leishmaniose visceral tem sido notificada em quase todos os estados do Brasil, e principalmente no norte de Minas Gerais, onde a doença é endêmica. Este estudo visou detectar a infecção natural de Lutzomyia longipalpis e identificar através da técnica de PCR/RFLP a espécie de Leishmania encontrada nos flebotomíneos do município de Janaúba.
MÉTODOS: Utilizando-se armadilhas luminosas, foram capturadas 1.550 fêmeas de L. longipalpis, que agrupadas em pool de 10 exemplares foram submetidas à extração e amplificação de DNA, através das técnicas de PCR genérico e cacofonia.
RESULTADOS: Dos 155 pools, seis apresentaram-se positivos para Leishmania sp., sendo a taxa de infecção do município de 3,9%. Através da PCR/RFLP determinou-se que o padrão de digestão das amostras positivas foi semelhante ao da cepa referência Leishmania chagasi(MHOM/BR/74/PP75).
CONCLUSÕES: A detecção de infecção natural associada a estudos sobre a epidemiologia da LV sugere que L. longipalpis esteja envolvida na transmissão de L. infantum chagasi em Janaúba, principalmente nas áreas de intensa transmissão de LV.
Palavras-chaves: Leishmaniose visceral. Infecção natural. Lutzomyia longipalpis. Leishmania infantum chagasi.
ABSTRACT
INTRODUCTION: Visceral leishmaniasis has been notified in nearly all states of Brazil, and particularly in the north of Minas Gerais, where the disease is endemic. The aim of this study was to detect natural infection of Lutzomyia longipalpis and, through the PCR/RFLP technique, identify Leishmania species found in sandflies in the municipality of Janaúba.
METHODS: Using light traps, 1,550 females of L. longipalpis were caught and grouped into pools of 10 specimens to be subjected to DNA extraction and amplification, by means of generic PCR and cacophony.
RESULTS: Out of the 155 pools, six were positive for Leishmania sp., and thus the infection rate in the municipality was 3.9%. Through PCR/RFLP, the digestion pattern among the positive samples was found to be similar to that of the reference strain of Leishmania chagasi (MHOM/BR/74/PP75).
CONCLUSIONS: The detection of natural infection associated with studies on the epidemiology of visceral leishmaniasis suggests that L. longipalpis is involved in transmission of L. infantum chagasiin Janaúba, particularly in areas of intense transmission of visceral leishmaniasis.
Keywords: Visceral leishmaniasis. Natural infection. Lutzomyia longipalpis. Leishmania infantum chagasi.
INTRODUÇÃO
A leishmaniose visceral (LV), ou calazar, é uma doença crônica grave, causada por espécies de Leishmania, pertecentes ao complexo Leishmania (Leishmania) donovani1. No Brasil, o agente etiológico Leishmania (Leishmania) chagasi (Cunha & Chagas, 1937), é transmitido ao homem através da picada de fêmeas da espécie L. (L.) longipalpis (Lutz & Neiva 1912).
A leishmaniose visceral encontra-se atualmente entre as sete endemias consideradas prioritárias no Mundo2. Nos últimos anos, a doença vem se tornando um importante problema de saúde pública, estando amplamente distribuída nos quatro continentes, principalmente em regiões tropicais e subtropicais da Ásia e Oriente Médio, sul da Europa, norte da África, América do Sul e Central. Nas Américas, a LV ocorre desde o México até a Argentina, sendo que cerca de 97% dos casos humanos descritos são procedentes do Brasil3.
O diagnóstico da LV pode ser feito através de métodos clássicos juntamente com evidências clínicas e epidemiológicas. No campo laboratorial, além dos exames parasitológicos de rotina e da avaliação da resposta sorológica, a reação da polimerase em cadeia (PCR) tem se mostrado um instrumento de grande sensibilidade no diagnóstico da LV através da pesquisa do DNA do parasita em materiais biológicos diversos2,4-10. A utilização da técnica de PCR na detecção do DNA de Leishmania iniciou-se em 1990, tendo como alvo as moléculas de minicírculos do parasita11. Esses autores demonstraram a sensibilidade do método capaz de detectar uma única forma amastigota de Leishmania (Viannia) braziliensis e até 1% do kDNA (ácido desoxirribonucléico de cinetoplasto) de uma amastigota de Leishmania (Leishmania) mexicana.
Além dos estudos clínicos, a PCR tem sido uma ferramenta eficiente em estudos epidemiológicos, na tentativa de incriminar animais silvestres e domésticos como hospedeiros ou reservatórios da doença, além de detectar a presença do parasito em flebotomíneos, sejam eles infectados experimentalmente, através de xenodiagnóstico ou infecção artificial e, também, em condições naturais. Esta técnica tem sido aplicada para analisar as diversas amostras destes insetos provenientes do campo, tendo em vista a dificuldade na detecção, identificação e caracterização dos organismos infectantes pelos métodos convencionais12-16.
Nos últimos anos, foi demonstrado que a PCR/RFLP (polymerase chain reaction/restriction fragment length polymorphism) é capaz de diferenciar L. (Leishmania) amazonensis de L. braziliensis em seres humanos infectados2. A mesma técnica pode também diferenciar L. amazonensis e L. braziliensis de L. chagasi. Em áreas endêmicas de LV e LTA, onde L. chagasi e L. braziliensis são simpátricas, é importante dispor de testes de diagnóstico não só para confirmar a presença do parasito em seus hospedeiros (homem e cão), mas também identificar e distinguir as espécies circulantes de Leishmania2 naquelas regiões.
O objetivo deste estudo foi detectar a infecção natural de L. longipalpis por Leishmania sp. em flebotomíneos infectados capturados no município de Janaúba, Minas Gerais.
MÉTODOS
Área de estudo
O Município de Janaúba localiza-se na mesorregião norte do Estado de Minas Gerais, na área do semiárido e na microrregião da Serra Geral de Minas, da qual é a cidade pólo. A área do município é de aproximadamente 2.260km2 e está a 516m de altitude, tendo sua posição determinada pelas seguintes coordenadas geográficas: 15047’503 de latitude sul e 43018’313 de longitude oeste.
Captura de flebotomíneos
As capturas de flebotomíneos foram realizadas em 15 residências do município de Janaúba. Para as coletas, foram utilizadas armadilhas luminosas do tipo HP(Hoover Pugedo), instaladas no peridomicílio dos bairros em estudo. Foram incluídos bairros de transmissão esporádica, moderada e intensa para LV de acordo com os critérios adotados pelo Ministério da Saúde17. Essas foram realizadas sempre na primeira semana de cada mês, ininterruptamente, durante duas noites consecutivas no período de 12 meses (abril/2006 a março/2007).
As fêmeas capturadas foram acondicionadas em dimetilsufóxido (DMSO 6%) e armazenadas em nitrogênio líquido. Essas foram dissecadas para determinação da espécie (L. longipalpis) e utilizadas em pool de 10 flebotomíneos para detecção da infecção através das seguintes técnicas: PCR genérico, gene da cacofonia e PCR-RFLP.
PCR de gene constitutivo específico de flebotomíneo (cacofonia)
Para a detecção do gene constitutivo do DNA de flebotomíneos (cacofonia) foi utilizado um par de iniciadores específicos da região IVS6 de flebotomíneos do gênero Lutzomyia18: 5Llcac 5′ GTG GCC GAA CAT AAT GTT AG 3′ e 3Llcac 5′ CCA CGA ACA AGT TCA ACA TC 3′. As reações foram preparadas para volume final de 25μl. A mistura para a reação foi feita utilizando kit para PCR (PureTaq Ready-To-Go PCR Beads/GE Healthcare) que contêm aproximadamente 2,5 unidades de PureTaqTM DNA polymerase, 10mM Tris-HCl (pH 9,0), 50mM KCl, 1,5mM MgCl2, 200μM dATP, dCTP, dGTP and dTTP e estabilizadores, incluindo BSA. A cada pérola foram adicionados 2μl de cada primer a 200ng cada e 19μl de água ultrapura. Em seguida, foram adicionados a estes 2μl de DNA na concentração foi de 10ng/μl. A amplificação do DNA foi realizada em equipamento termociclador automático (Perkin-Elmer-GeneAmpPCRSystem 2400). O programa de amplificação utilizado foi: 94°C por 12min, seguido de 35 ciclos de 94°C por 30s, 55°C por 30s, 72°C por 30s e uma extensão final a 72°C por 10min. A cada conjunto de reações de PCR foi sempre incluídos um controle negativo (sem DNA) e um controle positivo (DNA purificado de flebotomíneo do gênero Lutzomyia).
Após amplificação, as amostras foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida a 6% e impregnação por nitrato de prata.
A taxa de infecção natural foi expressa como taxa mínima de infecção (TMI), calculada dividindo-se o número de grupos positivos pelo número total de espécimens testados x 10019.
Detecção de infecção por Leishmania em flebotomíneos infectados naturalmente através da PCR
As fêmeas dissecadas e identificadas foram transferidas em pool de 10 para microtubos de fundo cônico e submetidas à extração de DNA. A extração de DNA foi realizada através da técnica fenol-clorofórmio. As amostras foram maceradas a seco (sob gelo), adicionados 50μl de tampão de lise (100mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 25mM EDTA, 0,5% SDS, pH 8,0), 1,0μl de solução aquosa de Proteinase K (10mg/mL) e incubadas a 37°C overnight. Posteriormente, foram adicionados 70μl de água ultrapura e 120μl de fenol saturado em tampão. Em seguida, foi feito o tratamento com 120μl de clorofórmio: isoamílico (24:1) e o DNA foi precipitado a -20°C overnight, adicionando-se 20μl de acetato de sódio 3M pH 5,2 e 200μl de etanol absoluto gelado. O precipitado foi lavado com 100μl de etanol 70% gelado. O DNA foi ressuspendido em 100μl de TE 1x e armazenado a -20°C.
A concentração e o grau de pureza do DNA foram estimados por leitura em espectofotômetro (Nano Drop) em 260nm e 280nm.
Para detectar a infecção, foi utilizada a PCR que amplifica a região conservada do minicírculo do kDNA de Leishmania20, utilizando-se os seguintes primers: 5’GGG GAG GGG CGT TCT GCG AA 3′, 5’CCG CCC CTA TTT TAC ACC AAC CCC 3′; 5’GGC CCA CTA TAT TAC ACC AAC CCC 3′ como descrito acima para a técnica de PCR cacofonia.
A amplificação do kDNA foi realizada em equipamento termociclador automático (Perkin-Elmer-GeneAmpPCRSystem 2400). O programa de amplificação utilizado foi: 94°C por 4min, seguido de 35 ciclos de 94°C por 30s, 60°C por 30s, 72°C por 30s e uma extensão final a 72°C por 10min7.
A cada conjunto de reações, foram incluídos um controle negativo (sem DNA) e um controle positivo (DNA purificado da cepa referência de L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903).
Após amplificação, as amostras foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida a 6% e impregnação por nitrato de prata.
PCR-RFLP KDNA
PCR-RFLP KDNA foi realizada nas amostras positivas2. Três microlitros do produto amplificado foram digeridos por adição de 0,1μl de Hae III 4,000U/ul e 1,0μl de tampão 10x concentrado (Amersham Biosciences), juntamente com 5,9μl de água ultrapura. A mistura foi incubada por 3h a 37°C e os fragmentos de restrição foram separados em gel de poliacrilamida a 10% impregnados por prata. Os fragmentos gerados foram comparados às amostras referência de L. amazonensis(IPLA/BR/67/PH8), L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2930) e L. chagasi (MHOM/BR/74/PP75).
RESULTADOS
Através da análise de cacofonia (gene constitutivo do DNA de flebotomíneos), todas as 155 amostras testadas mostraram-se positivas, validando tanto a extração de DNA como os resultados negativos. As Figuras 1A e 1B exemplificam resultados típicos obtidos.
Das 155 amostras analisadas, 50 eram de área esporádica, seis da área moderada e 99 da área intensa de transmissão de LV. O fragmento de 120pb característico de Leishmania sp foi observado em 6 dos 99 pools de amostras da área intensa, não tendo sido detectada qualquer amostra positiva para os exemplares provenientes de áreas moderada e esporádica (Figura 1C). A taxa mínima de infecção calculada para Janaúba foi de 3,9%.
A PCR/RFLP foi realizada nas 6 amostras positivas para Leishmania sp. Comparando-se os fragmentos de DNA gerados pela digestão dos produtos amplificados com os fragmentos de cepas de Leishmania de referência, observou-se que as amostras identificadas acompanharam o padrão de L. chagasi, conforme descrito na Figura 2.
DISCUSSÃO
O município de Janaúba, localizado ao norte do Estado de Minas Gerais, parece ilustrar o processo de expansão e urbanização da LV. Este foi recentemente caracterizado pelo Ministério da Saúde como área de intensa transmissão de LV, apresentando um número crescente de casos humanos notificados, aproximadamente 119 casos, nos últimos 5 anos (>4,4 casos/5 anos)17, mas além de áreas de transmissão intensa, o município apresenta áreas de transmissão moderada e esporádica.
Os 15 bairros (transmissão moderada, esporádica e intensa) onde foram realizadas as capturas entomológicas para detecção de infecção natural, não apresentavam características diferenciais marcantes, em sua maioria eram extremamente pobres, com deficiência na coleta de lixo e de saneamento básico, sendo que em algumas áreas muitos moradores possuem baixos índices socioeconômicos, a convivência com animais domésticos é bastante elevada, há presença de área sombreada, resultando em acúmulo de matéria orgânica e proporcionando assim condições favoráveis para a ocorrência da presença do vetor e transmissão da doença.
O crescimento não planejado da área urbana de Janaúba, assim como ocorrido em diversas cidades do Brasil, em outros municípios do norte de Minas Gerais, como Porteirinha, Montes Claros, Varzelândia, tem papel fundamental no desenvolvimento de agravos da saúde21-23. Este crescimento desordenado implica em uma série de transformações do meio ambiente e possibilita a instalação e expansão das leishmanioses, principalmente da LV, no município.
É conhecido que existe uma correlação entre a densidade de L. longipalpis e as condições observadas no peridomicílio e que esta espécie de flebotomíneo é frequentemente associada à presença de animais domésticos. A presença de L. longipalpis no meio urbano se deve principalmente à sua alta adaptabilidade ao ambiente modificado pelo homem, o que lhe confere um papel importante na epidemiologia da leishmaniose visceral. Esta espécie tem ampla distribuição geográfica ao longo do país, que em geral, coincide com a da LV24-26.
A detecção de infecção natural em fêmeas de L. longipalpis em áreas endêmicas de LV, tem papel fundamental no envolvimento desta espécie na transmissão da LV nestas áreas. A soma destes fatores associados aos diversos estudos que incriminam esta espécie como transmissora da L. infantum chagasi, aumentam as evidências da participação desta espécie no ciclo epidemiológico da LV5,14,16,27.
O método mais comumente utilizado na pesquisa de infecção natural é a dissecção, que é muito trabalhoso e consome muito tempo na pesquisa pelo parasito em loco, requerendo prática e habilidade na execução. Além disto, a confirmação dos casos positivos precisa ser feita através da cultura in vitro de Leishmania, frequentemente susceptível à contaminação ou ainda através da inoculação em animais de laboratório, pois outros flagelados são encontrados no trato digestivo destes insetos26,28.
A amplificação de DNA através da PCR constitui-se em uma alternativa prática e vantajosa, por ser um método altamente sensível e específico na detecção, caracterização e identificação de Leishmania spp. em amostras clínicas, reservatórios e vetores infectados7,13,29,30. As principais vantagens deste método molecular são sua sensibilidade e especificidade, que são pouco dependentes do número, estágio e localização dos parasitos no trato digestivo do inseto9.
É extremamente importante identificar as espécies de Leishmania que circulam em um determinado foco de transmissão, principalmente quando o alvo é a epidemiologia da doença. Sabe-se que o agente etiológico responsável pela LV no novo mundo é a L. infantum chagasi, porém diversas regiões do Brasil são endêmicas para leishmaniose tegumentar (LT) e LV31. Portanto, neste trabalho utilizamos a PCR/RFLP2 para determinar a espécie de Leishmaniaencontrada em fêmeas de flebotomíneos infectados do município de Janaúba, já que este apresenta casos humanos de LV e LT.
A contaminação pôde ser evitada e acompanhada através da utilização de rígidos controles negativos, e controle interno a partir da utilização de iniciadores para amplificar o gene constitutivo específico (cacofonia) de flebotomíneos para a certificação da extração de DNA e confirmação dos resultados negativos18.
Neste estudo, foi possível detectar a infecção de fêmeas de L. longipalpis por L. infantum chagasipela primeira vez no município de Janaúba, ficando a taxa de infecção natural do município em 3,9%.
Sabemos que a taxa de infecção de Leishmania no vetor é considerada baixa na natureza, mesmo em áreas endêmicas para LV, mas baseado no alto grau de antropofilia e capacidade vetorial de L. longipalpis, no registro de casos autóctones de LV e na abundância e distribuição espacial desta espécie coincidente com a área de ocorrência da doença, podemos sugerir sua participação no ciclo de transmissão da LV no município.
A detecção de flebotomíneos infectados naturalmente ter ocorrido somente em 2 bairros de intensa transmissão (Saudade e Padre Eustáquio), não teve relação direta com a densidade populacional e taxa de prevalência canina alta. Como por exemplo, o bairro Algodões (transmissão esporádica), sem ocorrência de casos humanos, sem presença de vetor infectado naturalmente, prevalência canina de 10% e elevada densidade populacional de flebotomíneos capturados32, como também outros bairros de transmissão moderada e intensa não apresentaram flebotomíneos infectados naturalmente, mas apresentava tanto prevalência canina alta (> 20%), quanto densidade populacional elevada. Portanto, a infecção natural ter ocorrido somente em bairros de transmissão intensa foi ocasional, sendo necessários estudos relacionados com outros possíveis vetores da LV.
Através desses resultados, pode-se inferir que a utilização da PCR na detecção de flebotomíneos infectados naturalmente, parece superar em grande parte os problemas encontrados nos métodos de dissecção de flebotomíneos, como baixa sensibilidade e especificidade na detecção e identificação do parasito. Portanto, essas qualidades aliadas à confirmação parasitológica através da detecção de infecção natural pelo PCR genérico e até mesmo da espécie de Leishmaniacirculante no vetor pela PCR/RFLP, exercem um papel fundamental em estudos epidemiológicos, permitindo um melhor entendimento da relação entre o vetor, o agente etiológico e seus reservatórios na transmissão da LV no município de Janaúba.
AGRADECIMENTOS
Aos funcionários do Setor de Vigilância e Fatores Ambientais da Secretaria Municipal de Saúde de Janaúba, pela colaboração nas capturas e também pelo apoio logístico e aos moradores do município pela cooperação.
CONFLITO DE INTERESSE
Os autores declaram não haver nenhum tipo de conflito de interesse no desenvolvimento do estudo.
SUPORTE FINANCEIRO
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Universidade Federal do Triângulo Mineiro e Fundação Oswaldo Cruz.
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Endereço para correspondência:
Dr. Edelberto Santos Dias
Lab. Leishmanioses/CPqRR/FIOCRUZ
Av. Augusto de Lima 1715, Barro Preto
30190-002 Belo Horizonte, MG
Tel: 55 31 3349-7758
e-mail: edel@cpqrr.fiocruz.br
Recebido para publicação em 14/07/2010
Aceito em 16/09/2010
