Emanuele Júlio Galvão de FrançaI; Daniel FáveroI; Henrique ScreminI; Marcelo Tempesta de OliveiraI; Luciana Furlaneto-MaiaII; Regina Mariuza Borsato QuesadaIII; Márcia Cristina FurlanetoI
IDepartamento de Microbiologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Londrina, Londrina, PR IIDepartamento de Ensino, Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Londrina,PR IIICentro de Ciências da Saúde, Universidade Estadual de Londrina, Londrina, PR
RESUMO
INTRODUÇÃO: Leveduras do gênero Candida são responsáveis pela maioria das infecções fúngicas em humanos. Candida tropicalis tem sido uma das mais comumente isoladas dentre as espécies não-albicans. O objetivo foi analisar a hemólise in vitro promovida por isolados clínicos de C. tropicalis provenientes de sangue e outras amostras clínicas de pacientes internados no Hospital Universitário da UEL, PR-Brasil.
MÉTODOS: Foi avaliada a hemólise promovida por 28 isolados clínicos de C. tropicalis, sendo os isolados agrupados em classes de acordo com os níveis de hemólise.
RESULTADOS: A maioria dos isolados de sangue apresentou hemólise fraca (+), enquanto as classes de hemólise forte (+++) e muito forte (++++) foram as predominantes nos isolados de outras amostras clínicas como urina, lesão de unha e secreção traqueal, embora não tenham sido detectadas diferenças estatísticas (p>0,05).
CONCLUSÕES: Isolados de C. tropicalis, obtidos de diferentes amostras clínicas, apresentam capacidade de promover hemólise in vitro.
Palavras-chaves: Candida tropicalis. Hemólise. Amostras clínicas. Sangue.
ABSTRACT
INTRODUCTION: Yeasts belonging to the genus Candida are responsible for the majority of fungal infections in humans. Candida tropicalis has been one of most commonly isolated non-albicans species. To analyze in vitro hemolysis promoted by clinical isolates of C. tropicalisobtained from blood and other clinical samples from hospitalized patients at the University Hospital of Londrina State University, Paraná, Brazil.
METHODS: The hemolysis promoted by 28 clinical isolates of C. tropicalis was evaluated, and the isolates were grouped into classes according to the hemolysis levels.
RESULTS: The majority of the blood isolates showed weak hemolysis (+), while the classes of strong hemolysis (+++) and very strong hemolysis (++++) predominated among isolates from other clinical samples such as urine, nail lesions and tracheal secretions. However, no statistical differences were detected (p> 0.05).
CONCLUSIONS: Isolates of C. tropicalis obtained from different clinical samples showed a capacity to promote in vitro hemolysis.
Key-words: Candida tropicalis. Hemolysis. Clinical samples. Blood.
INTRODUÇÃO
Leveduras do gênero Candida têm sido descritas como os principais patógenos fúngicos em humanos1,2. Embora Candida albicans seja a espécie mais amplamente diagnosticada em isolados clínicos, diversos estudos relatam um aumento significativo na frequência de isolados de outras espécies do gênero3. C. tropicalis possui particular importância devido ao aumento em seus índices de isolamento. Segundo Pfaller e cols4, os índices de isolamento desta espécie em todo o mundo aumentaram 2,9% no período de 1997 a 2003.
No Brasil, estudos realizados em diferentes períodos demonstraram que cerca de 20% dos episódios de candidemia foram causados por C. tropicalis5,6, sendo uma das principais espécies responsáveis por este tipo de infecção em hospitais públicos do país6-8. C. tropicalis também tem sido amplamente relacionada a episódios de candidúria, sendo a terceira espécie mais frequentemente isolada de culturas de urina9-10, além de infecções do trato respiratório11 e de onicomicoses12,13.
A habilidade de um microrganismo em adquirir ferro elementar é fundamental para a sobrevivência e o estabelecimento da infecção14. Muitos patógenos secretam fatores hemolíticos com o objetivo de obter hemoglobina ou o grupo prostético heme como fontes de ferro, a partir da lise de eritrócitos15.
Manns e cols16 foram os primeiros autores a descrever que C. albicans é capaz de induzir hemólise em sangue de carneiro. Posteriormente, Watanabe e cols17-18 demonstraram que o fator hemolítico secretado por C. albicans é uma manoproteína que provoca a lise de eritrócitos, em decorrência de sua ligação à proteína Banda 3. Segundo esses autores, a ocorrência de hemólise nos sítios de infecção pode favorecer a proliferação da levedura.
Dados relativos à produção de fator hemolítico por C. tropicalis são escassos19-21. O presente estudo teve por objetivos avaliar a atividade hemolítica in vitro de isolados clínicos de C. tropicalise comparar a hemólise promovida por isolados provenientes de sangue e de outras amostras clínicas (urina, secreção traqueal e lesões superficiais).
MÉTODOS
Neste estudo foram utilizados 28 isolados de C. tropicalis, provenientes de diferentes amostras clínicas de pacientes atendidos e internados no Hospital Universitário da Universidade Estadual de Londrina. Os isolados foram obtidos de estudo relativo à frequência de espécies de Candidarealizado no período de 2005 a 200722. Destes, 10 foram isolados de sangue (grupo 1) e 18 de amostras clínicas distintas (8 urina, 6 secreção traqueal e 4 lesão de unha), sendo agrupados como não-sangue (grupo 2). Os isolados fazem parte da coleção de leveduras do Laboratório de Genética e Biologia Molecular de Fungos da Universidade Estadual de Londrina, Londrina, PR. As leveduras foram mantidas congeladas em meio Sabouraud (4% glicose; 1% peptona; 0,25% extrato de levedura) com 20% de glicerol e armazenadas a -20°C. A identificação dos isolados foi realizada utilizando o meio cromogênico CHROMagar® Candida e confirmada por PCR, conforme Furlaneto-Maia e cols19.
A atividade hemolítica in vitro dos isolados foi avaliada utilizando o ensaio descrito por Furlaneto-Maia e cols19, com modificações. Os isolados foram inoculados em 3mL de meio Sabouraud e incubados por 18 horas a 37°C, sob agitação. As células foram lavadas e 2×105 células foram inoculadas em gota sobre a superfície de meio Sabouraud solidificado, suplementado com 7% de sangue fresco de carneiro. As placas foram incubadas a 37°C, por 48 horas e o perfil de hemólise analisado. O experimento foi repetido três vezes.
A hemólise obtida foi classificada em fraca (+), média (++), forte (+++) ou muito forte (++++), de acordo com a quantificação dada pela fórmula (H – C)/2, sendo H a medida, em mm, do halo interno translúcido somado ao do halo externo marrom-esverdeado (Figura 1) e C o diâmetro da colônia.
As análises estatísticas foram realizadas aplicando-se o teste t de Student (BioStat versão 5.4.0). Valores de p menores que 0,05 foram considerados significativos.
RESULTADOS
Do total de 28 isolados de C. tropicalis analisados, 100% promoveram hemólise em meio Sabouraud suplementado com 7% de sangue de carneiro, como ilustrado na Figura 1. Deste total, 40% dos isolados do grupo 1 (sangue) e 16,7% do grupo 2 (não-sangue) apresentaram hemólise fraca (+). Dentre os isolados do grupo 2, os de urina e de lesão de unha apresentaram predominantemente hemólise forte (+++), enquanto os isolados de secreção traqueal apresentaram os maiores níveis de hemólise (++++) (Tabela 1).
Entre os isolados de sangue a hemólise variou de 3,19 a 5,25mm, já os isolados do grupo 2 apresentaram amplitude de distribuição que variou de 1,5 a 6,33mm. Não foi observada diferença significativa nos níveis de hemólise entre estes grupos (p>0,05).
Como observado na Figura 2, dentre os isolados do grupo 2, os provenientes de urina apresentaram hemólise variando de 1,5 a 5,31mm. Destes, 50% foram classificados como de hemólise forte (+++), não diferindo estatisticamente do grupo 1 (sangue) (p>0,05).
Os valores de hemólise dos isolados de secreção traqueal variaram de 2,58 a 6,33mm, sendo que 50% desses apresentaram hemólise muito forte (++++) (Figura 2). Já os isolados de lesão de unha apresentaram valores de hemólise entre 3,0 a 5,17mm, com 50% de hemólise forte (+++) (Figura 2). A hemólise promovida pelos isolados obtidos de amostras clínicas distintas (urina, secreção traqueal e de lesão de unha) não foi significativamente diferente (p>0,05) dos obtidos para isolados de sangue (Figura 2).
DISCUSSÃO
O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade hemolítica promovida por C. tropicalis empregando isolados clínicos obtidos de estudo realizado no HU da Universidade Estadual de Londrina no período de 2005 a 2007. Todos os isolados de C. tropicalis, independente da origem, foram capazes de promover hemólise, concordando com dados da literatura19-21 indicando a habilidade desta espécie em disponibilizar potenciais fontes de ferro. Segundo Manns e cols16, C. albicanspossui a capacidade de utilizar ferro derivado de hemoglobina, por meio da produção de um fator responsável pela lise dos eritrócitos, uma habilidade que pode ser compartilhada por C. tropicalis e representar uma vantagem adaptativa para o estabelecimento de infecções em seus hospedeiros.
A partir da quantificação da hemólise, os isolados foram agrupados em diferentes classes, refletindo uma capacidade diferencial, entre isolados, de gerar lise nos eritrócitos. Para evitar o efeito de repicagens sucessivas na produção de fator hemolítico, os isolados foram mantidos sob refrigeração (-20°C) e após descongelamento foram imediatamente cultivados para avaliação da atividade hemolítica.
Neste estudo, a maioria dos isolados de sangue foi agrupada na classe representativa de hemólise fraca (+), enquanto a maioria dos isolados obtidos de outras amostras clínicas (grupo 2) demonstrou maior nível de hemólise. Dentre estes, destacam-se os provenientes de secreção traqueal, já que em sua maioria foram agrupados na classe de hemólise muito forte.
Considerando que estudos relativos a produção de hemólise por espécies de Candida são escassos e que o presente trabalho representa o primeiro estudo de avaliação de hemólise promovida por isolados de Candida provenientes de sangue comparativamente a de isolados provenientes de amostras clínicas distintas (urina, secreção traqueal e lesão superficial), estudos posteriores deverão ser conduzidos com o objetivo de elucidar o significado da ocorrência de diferentes capacidades hemolíticas observadas para isolados obtidos de amostras clínicas distintas e seu eventual papel na patogenia. Estudos comparativos semelhantes foram realizados para a produção de outros fatores de virulência em Candida sp. Kumar e cols23 demonstraram que isolados de diferentes espécies de Candida não-albicans, incluindo C. tropicalis, provenientes de amostras clínicas distintas apresentaram diferentes potenciais de produção de enzimas hidrolíticas. Segundo estes autores, a maioria dos isolados provenientes de sangue foi agrupada na classe referente aos menores valores de atividade proteolítica e fosfolipásica. Da mesma forma, isolados de Candida parapsilosis obtidos de sangue apresentaram menores atividades proteolíticas comparativamente aos isolados obtidos de outras amostras clínicas24,25. Até o momento, não existem dados na literatura que demonstrem as bases moleculares relacionadas a expressão diferencial destes fatores de virulência por amostras de sangue.
Embora, neste estudo, a produção de hemólise por isolados distintos, independente da origem de isolamento, não tenha sido significativamente diferente (p>0,05), os níveis de hemólise promovidos pelos diferentes isolados foram variáveis.
AGRADECIMENTOS
Os autores Emanuele Julio Galvão de França, Daniel Favero e Marcelo Tempesta de Oliveira agradecem à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior pela concessão de bolsas.
CONFLITO DE INTERESSE
Os autores declaram não haver nenhum tipo de conflito de interesse no desenvolvimento do estudo.
SUPORTE FINANCEIRO
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), à Fundação Araucária/SETI/Governo do Paraná/Brazil, Ministério da Saúde/DECIT, MCT/CNPq e Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da Universidade Estadual de Londrina.
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Endereço para correspondência:
Dra. Márcia C. Furlaneto
Depto. de Microbiologia/CCB/UEL
Caixa Postal 6001
86051-990 Londrina, PR
Tel: 55 43 3371-5736
e-mail: furlaneto@uel.br
Recebido para publicação em 13/10/2009
Aceito em 05/03/2010
