Vani Dos Santos LaranjeiraI; Desiree Padilha MarchettiII; Juçara Rodrigues SteyerIII; Gertrudes CorçãoII; Simone Ulrich PicoliI
IInstituto de Ciências da Saúde, Universidade Feevale, Novo Hamburgo, RS IIDepartamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS IIIHospital de Pronto Socorro de Porto Alegre, Porto Alegre, RS
RESUMO
INTRODUÇÃO: O aparecimento de Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter sp produtores de metalo-β–lactamases (MBLs) é um desafio para os hospitais.
MÉTODOS: Verificou-se a produção de MBL em cepas clínicas de Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter sp de um hospital de emergência de Porto Alegre pelo método de aproximação de disco e E-test MBL. Os genes bla foram pesquisados pela PCR.
RESULTADOS: Duas cepas de Pseudomonas aeruginosa e oito Acinetobacter sp demonstraram fenótipo de MBLs. A amplificação do gene blaSPM-1 confirmou a enzima em P. aeruginosa..
CONCLUSÕES: Deve-se ter cautela ao avaliar testes fenotípicos utilizados na detecção rotineira de metalo-enzima.
Palavras-chaves: Bacilos Gram-negativos. Não-fermentadores. Metalo-β–lactamase.
ABSTRACT
INTRODUCTION: The appearance of metallo-β-lactamase (MBL)-producing Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter sp. is a challenge for hospitals.
METHODS: The production of MBL in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter sp. From an emergency hospital in Porto Alegre was investigated using the disk approximation test and MBL E-test. The bla genes were determined using PCR.
RESULTS: Two strains of Pseudomonas aeruginosa and eight of Acinetobacter sp were shown to be MBL phenotypes. Amplification of the blaSPM-1 gene confirmed the presence of the enzyme in P. aeruginosa.
CONCLUSIONS: Caution is needed in evaluating phenotype tests used for routine detection of metallo-β-lactamases.
Key-words: Gram-negative bacilli. Nonfermenting bacteria. Metallo-β–lactamase.
O principal problema em unidades de terapia intensiva (UTIs) brasileiras é a emergência de bactérias Gram-negativas não fermentadoras de glicose (BGNNFG) com sensibilidade antimicrobiana diminuída, tornando-se constante desafio para os profissionais da área da saúde. Nesse contexto, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter sp vêm adquirindo importância como agentes de infecções hospitalares devido a crescente resistência aos antimicrobianos. Esses microrganismos são agentes etiológicos de quase todas as infecções adquiridas na UTI, em particular as do trato respiratório1-3. São responsáveis diretos pelas altas taxas de morbi-mortalidade e aumento do tempo de internação, com elevados custos para o hospital4.
Em vista do aumento na prevalência global de espécies de Pseudomonas resistentes às terapias utilizadas para o tratamento das infecções hospitalares, e os recentes surtos nosocomais por Acinetobacter multirresistente é justificável a realização de estudos locais de prevalência. Além disto, entre todos os mecanismos de resistência aos β-lactâmicos apresentados por estas bactérias, o conhecimento da produção da enzima MBL (metalo-β-lactamase) tem sido amplamente pesquisado.
Considerando a relevância dos microrganismos capazes de hidrolisar carbapenens, a vigilância e o controle de cepas resistentes tornam-se importantes nos hospitais, principalmente em locais onde a disseminação desses patógenos ainda é elevada, bem como naqueles onde é desconhecida pelo risco da não-identificação, seja por falha laboratorial ou mecanismos de vigilância inadequados1. Este estudo determinou a ocorrência de metalo-β-lactamase em cepas de P. aeruginosa e Acinetobacter sp resistentes a cefalosporinas de terceira geração em hospital de emergência do sul do Brasil, através de dois testes fenotípicos e relacionou com a presença de genes bla.
Entre os meses de agosto e outubro de 2008, foram obtidas 13 cepas não repetitivas de P. aeruginosa (nº = 4) e Acinetobacter sp (nº = 9) com sensibilidade reduzida a cefalosporinas de terceira geração (ceftazidima ou cefotaxima ou ceftriaxona) de um hospital de emergência de Porto Alegre. Provas bioquímicas, amplificação e sequenciamento do 16S rDNA foram realizados para identificação das cepas5. O teste de sensibilidade aos antimicrobianos foi conduzido segundo o Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)6. A determinação fenotípica de MBLs foi realizada pela aproximação de disco com ceftazidima (CAZ) e ácido 2-mercaptopropiônico (2-MPA)7 e pelo E-test MBL (AB Biodisk, Dalvägen, Solna, Sweden). Para confirmar a presença de genes de MBL em P. aeruginosa e Acinetobacter sp fenotipicamente positivas, foi realizada a amplificação dos genes blaIMP-1, blaSPM-1, blaVIM-15. Adicionalmente, foi realizada a amplificação dos genes blaOXA-23 e blaOXA-51 nas cepas de Acinetobacter sp. Em todas as análises, empregou-se a cepa P. aeruginosa ATCC 27853 como controle negativo e cepas de P. aeruginosa e Acinetobacter baumanii portadoras dos genes analisados como controles positivos.
Em relação ao perfil de sensibilidade ao imipenem, sete cepas de Acinetobacter sp e duas P. aeruginosa apresentaram resistência. Todas as 13 cepas foram resistentes a ceftazidima e três P. aeruginosa resistentes, também, ao aztreonam. Dentre as 13 cepas avaliadas, nove Acinetobacter sp e duas P. aeruginosa tiveram teste fenotípico (E-test MBL) positivo para MBL, mas todas foram negativas no teste CAZ/2-MPA. A maioria das cepas estudadas demonstrou razões de CIM de imipenem e imipenem com EDTA entre 12 a 42µg/mL e um isolado de P. aeruginosa apresentou este valor extremamente elevado (256µg/mL) (Tabela 1).
As duas cepas de P. aeruginosa com fenótipo de MBL foram positivas apenas para o gene blaSPM-1. Os genes blaSPM-1, blaVIM-1 e blaIMP-1 não foram encontrados entre as cepas de Acinetobacter sp. Contudo, a pesquisa do gene blaOXA-23 foi positiva em oito cepas de Acinetobacter sp e quatro continham, simultaneamente, o gene blaOXA-51. A presença deste gene é uma indicação que estas quatro cepas sejam A. baumanii (Tabela 1).
Apesar da detecção da resistência pelos laboratórios clínicos de microbiologia ser uma ferramenta valiosa para os serviços de controle de infecção hospitalar, a prática ainda constitui um grande problema, pois a maioria dos isolados resistentes apresenta mais de um mecanismo envolvido e várias recomendações têm sido descritas para melhorar sua pesquisa. No entanto, até o momento, o CLSI não sugere nenhum teste para detecção de amostras produtoras de MBL, contrariando a realidade brasileira, onde diversos estudos apontam a presença dessa enzima em cepas de P. aeruginosa, Acinetobacter sp e Enterobacteriaceae isoladas em distintos hospitais3,8.
Classicamente, as bactérias produtoras de MBL são sensíveis ao aztreonam, mas os nossos resultados demonstraram que nenhuma cepa de P. aeruginosa apresentou este comportamento. Assim, é provável que exista outro mecanismo de resistência nestas bactérias, provavelmente a produção de uma ESBL. Segundo Arakawa e cols7, o substrato mais adequado para pesquisa de metalo-enzima é a ceftazidima (30µg), pois amostras produtoras de MBLs usualmente demonstram alto nível de resistência a este antimicrobiano (CIM > 64µg/mL), além de considerável efeito inibitório dos compostos tiólicos (2-MPA). Contudo, no presente estudo nenhuma das cepas pôde ser detectada por esta metodologia.
Estudos de comparação entre testes fenotípicos para a detecção de metalo-β-lactamases foram realizados demonstrando que os mesmos são pouco eficientes para isolados do gênero Acinetobacter9. Existe grande discordância na literatura quanto à melhor técnica fenotípica para detecção de MBL. Alguns trabalhos mostram que o 2-MPA oferece maior sensibilidade7,10 apesar da interpretação ser difícil e subjetiva, enquanto outros apontam que o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) pode ser usado com sucesso11. Walsh e cols11 orientam que a realização de testes específicos para a detecção de MBL não tem impacto significativo na conduta terapêutica, pois a maioria absoluta dos isolados produtores desta enzima já apresenta resistência aos carbapenens quando testados por disco difusão. Possivelmente, tais discrepâncias estejam relacionadas com a espécie bacteriana em estudo e os tipos de metalo-enzimas envolvidos.
Com emprego de EDTA (E-test MBL), a maioria das cepas apresentou fenótipo de MBL, mas somente duas continham o gene blaSPM-1. Os resultados falso-positivos ocorreram em todas as nove cepas de Acinetobacter sp e em duas P. aeruginosa. Este achado pode ser explicado pela ação do EDTA sobre a permeabilidade da parede celular que aceleraria a decomposição do imipenem e diminuiria a expressão de proteínas de membrana12. Igualmente, a presença de agente quelante, EDTA, pode promover a conversão de enzimas OXA em suas formas monovalentes que são menos ativas sobre os carbapenens13. Por isso, recomenda-se cautela na interpretação de E-test MBL.
No presente estudo, a resistência aos carbapenens em Acinetobacter sp foi atribuída à presença de genes blaOXA-23 e blaOXA-51. A presença de oxacilinase tipo OXA-23 na maioria das cepas de Acinetobacter sp denota a sua relevância tanto por seu potencial de disseminação quanto por seu espectro de ação. Os genes para a enzima tipo OXA-51 ocorrem naturalmente em isolados da espécie A. baumanii, não aparecendo em outras espécies deste gênero14. Por esta razão, muitos estudos têm utilizado o gene blaOXA-51like para a identificação desta espécie, que é a mais comum em infecções nosocomiais causadas pelo gênero Acinetobacter. A presença deste gene não está necessariamente relacionada com resistência a carbapenens, pois depende da sequência ISAba1, o qual quando localizado acima do blaOXA-51 funciona como promotor da expressão, contribuindo para o aumento dos níveis de resistência a carbapenens15.
Apesar da detecção fenotípica de MBL nos isolados de P. aeruginosa e Acinetobacter sp resistentes à ceftazidima, são necessários testes moleculares para confirmar o fenótipo de metalo-enzima nas respectivas bactérias. Portanto, deve-se interpretar cautelosamente o resultado fenotípico de MBL obtido com E-test® MBL dado o elevado número de resultados falso-positivos. Por outro lado, o teste de disco aproximação CAZ/2-MPA subestimou a presença da metalo-enzima em P. aeruginosa.
CONFLITO DE INTERESSE
Os autores declaram não haver nenhum tipo de conflito de interesse no desenvolvimento do estudo.
SUPORTE FINANCEIRO
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Universidade Feevale.
REFERÊNCIAS
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Endereço para correspondência:
Drª. Gertrudes Corção
Deptº de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia/ICBS/UFRS
R. Sarmento Leite 500/sala 158, Cidade Baixa
90050-170 Porto Alegre, RS
Telefax: 55 51 3308-4111
e-mail: corcao@ufrgs.br
Recebido para publicação em 06/11/2009
Aceito em 09/04/2010
