Monique Ribeiro Tiba; Gustavo Prado Nogueira; Domingos da Silva Leite
Laboratório de Antígenos Bacterianos II, Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas. SP
RESUMO
Amostras de Escherichia coli, isoladas de pacientes do sexo feminino com quadro clínico de cistite, foram caracterizadas quanto à presença de fatores de virulência associados à formação de biofilme e ao agrupamento filogenético. Os resultados da reação em cadeia da polimerase demonstraram que todas as amostras foram positivas para o gene fimH (fímbria do tipo1), 91 amostras foram positivas para o gene fliC (flagelina) 50 amostras positivas para o gene papC (fímbria P), 44 amostras positivas para o gene kpsMTII (cápsula) e 36 amostras positivas para o gene flu(antígeno 43). Os resultados dos ensaios de quantificação da formação de biofilme demonstraram que 44 amostras formaram biofilme em microplacas de poliestireno e 56 amostras apresentaram resultado ausente/fraco. Também confirmamos a incidência das amostras de Escherichia coli no grupo filogenético B2 e D.
Palavras-chaves: Escherichia coli uropatogênica. Reação em cadeia da polimerase. Biofilme bacteriano.
ABSTRACT
Escherichia coli samples isolated from female patients with cystitis were characterized with regard to the presence of virulence factors associated with biofilm formation and phylogenetic groupings. Polymerase chain reaction results demonstrated that all the samples were positive for the gene fimH (type 1 fimbriae), 91 for fliC (flagellins), 50 for papC (P fimbriae), 44 for kpsMTII (capsules) and 36 for flu (antigen 43). The results from assays to quantify the biofilm formation demonstrated that 44 samples produced biofilm on polystyrene microplates and 56 samples produced weak or no biofilm. We also confirmed that Escherichia coli samples were present in phylogenetic groups B2 and D.
Key- words: Uropathogenic Escherichia coli. Polymerase chain reaction. Bacterial biofilm.
Escherichia coli uropatogênica (UPEC) é o principal agente que ocasiona infecções no trato urinário (ITU), além de ser uma das fontes mais comuns de bacteremia em indivíduos hospitalizados17. Este agente é responsável por 80% das ITUs, sendo que, 95% de todas estas infecções, desenvolvem-se em uma rota ascendente12.
Dentre os principais fatores de virulência, presentes no estabelecimento da infecção no trato urinário, estão as adesinas (fímbria do tipo 1, fímbria P, fímbria S, adesinas Afa/Dr), que promovem a colonização e formação de biofilme15.
Escherichia coli uropatogênica também tem sido encontrada formando biofilme bacteriano, que confere importantes vantagens aos microrganismos como resistência à desidratação e oxidação e maior tolerância a detergentes e antibióticos2 6.
Diversas linhagens de Escherichia coli patogênica ou comensais são capazes de colonizar superfícies pela expressão de estruturas de adesão como flagelo, pili conjugativo, polissacarídeos extracelulares e curli, formando o biofilme bacteriano2.
Foi descrito o papel da adesina antígeno 43 (Ag43), atuando na persistência da UPEC no trato urinário21. A expressão do Ag 43, codificada pelo gene flu, resulta em auto-agregação das células, promovendo a formação de biofilme bacteriano e a sobrevivência e persistência da bactéria durante uma infecção prolongada9.
A expressão da fímbria do tipo 1 tem sido reportada por ser esta uma importante estrutura para formação do biofilme, devido sua adesão celular inicial23. Enquanto a adesão mediada pela fímbria do tipo 1 é importante durante os estágios iniciais de colonização, a motilidade e quimiotaxia do flagelo bacteriano permitem que a UPEC se dissemine para novos sítios do trato urinário, tanto para obter nutrientes quando estes se tornam limitados, quanto para escapar da resposta imune do hospedeiro10. Como as infecções do trato urinário ocorrem de maneira ascendente, tem-se sugerido que a motilidade mediada pelo flagelo contribua para a virulência das bactérias, uma vez que permite a disseminação bacteriana no trato urinário10.
Os polissacarídeos capsulares são produzidos por muitas UPEC e estão associados à proteção contra a fagocitose, além de contribuírem para a formação de biofilme na bexiga14. Porém, estudos demonstram que a expressão da cápsula é reduzida na formação do biofilme, por mascarar outras estruturas de superfície18. Estudos epidemiológicos moleculares demonstraram que amostras de Escherichia coli podem ser divididas em quatro grupos filogenéticos designados A, B1, B2 e D3. Amostras que causam infecções extra-intestinais, como ITU, meningite e septicemia, têm sido classificadas no grupo B2, ou, menos frequentemente, no grupo D24. Amostras dos grupos B2 e D são conhecidas por possuírem mais fatores de virulência do que as amostras pertencentes aos grupos A e B116.
O objetivo deste trabalho foi caracterizar genotipicamente 100 amostras de Escherichia coliuropatogênicas, quanto aos fatores de virulência associados à formação de biofilme, bem como demonstrar em ensaios fenotípicos a formação de biofilme e motilidade. Além disso, foi realizado o estudo do agrupamento filogenético das cepas de Escherichia coli uropatogênicas.
MATERIAL E MÉTODOS
Amostras bacterianas. Foram utilizadas 100 amostras de Escherichia coli, coletadas na década de 1990, e isoladas de pacientes do sexo feminino, atendidas nos ambulatórios do Hospital das Clínicas da Universidade de Campinas (UNICAMP), Campinas, São Paulo, apresentando quadro clínico de cistite. Foram excluídas as pacientes, que no momento da coleta, apresentassem febre, e/ou mal estado geral que pudesse caracterizar suspeita clínica de pielonefrite aguda ou qualquer quadro infeccioso. Pacientes com anomalias do trato urinário, ou qualquer doença de base também foram excluídos. O diagnóstico de cistite foi baseado pelos sintomas clínicos típicos como ardor à micção, polaquiúria, urgência urinária e/ou perda urinária de esforço e urocultura com contagem de colônias superior a 105UFC/ml, com crescimento de um único tipo de microrganismo.
Estas amostras são pertencentes à Bacterioteca do Laboratório de Antígenos Bacterianos II, Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biologia, UNICAMP, Campinas, São Paulo.
Obtenção de DNA para reação em cadeia da polimerase. As amostras foram cultivadas em caldo de infusão de cérebro e coração (BHI) a 37ºC por 24 horas. Após este procedimento, foram repicadas em ágar TSA (ágar tripticase de soja) a 37ºC por 24h para obtenção de crescimento confluente. Em seguida, um raspado de cada uma das amostras foi ressuspendido em 100µL de água deionizada estéril. A suspensão bacteriana obtida foi fervida por 10 minutos e centrifugada a 10.000rpm por 2 minutos. Os sobrenadantes assim obtidos foram utilizados para a reação em cadeia da polimerase (PCR).
Reação em cadeia da polimerase. A reação em cadeia da polimerase foi realizada utilizando-se iniciadores específicos para os genes: papC (proteína de membrana externa da fímbria P), fimH (adesina da fímbria do tipo1), kpsMTII (cápsula), fliC (flagelo), flu (antígeno 43), chuA, yja, tspE(grupos filogenéticos). A seqüência dos iniciadores, temperatura de anelamento e peso molecular dos produtos estão especificados na Tabela 1.
Os produtos da PCR foram aplicados em gel de agarose 1,5%-2%, sendo identificados mediante incubação em solução de brometo de etídio e visualizados em transiluminador de luz UV. Para registro, os géis foram fotografados no sistema ImageMaster VDS (Amersham Pharmacia Biotech Inc. EUA).
Quantificação da formação de biofilme. A formação de biofilme foi realizada através da utilização de microplacas de poliestireno com 96 orifícios de fundo chato (Costar®‚ 3596)20. As amostras foram classificadas de acordo com a produção de biofilmes em quatro grupos: não produtoras, fracas, moderadas ou fortes.
Teste de motilidade. As cepas de Escherichia coli foram semeadas em uma das extremidades de tubos U contendo meio de cultura semi-sólido MIL (Himedia) e incubados por 24 horas a 37ºC.
RESULTADOS
Um total de 100 amostras de Escherichia coli uropatogênicas foram genotipicamente caracterizadas através do método da PCR. Os resultados da PCR demonstraram que todas as amostras (100%) foram positivas para o gene fimH,91 (91%) amostras foram positivas para o gene fliC, 50 (50%) amostras positivas para o gene papC, 44 (44%) amostras positivas para o gene kpsMTII e 36 (36%) amostras positivas para o gene flu.
Considerando que dentre as 100 amostras analisadas, 50% também possuíam o gene para a fímbria P, as amostras foram divididas em dois grupos para análise dos resultados. No Grupo1, foram reunidas as amostras positivas para os genes papC e no Grupo 2 as negativas para o mesmo gene papC. Os resultados da PCR estão presentes na Tabela 2.
O gene flu foi encontrado em 27 amostras do grupo 1, e em nove amostras do grupo 2 (Tabela 2). Já no teste fenotípico, 29 amostras do grupo 1 formaram biofilme moderado ou forte e no grupo 2 foram encontradas 15 amostras formando biofilme moderado ou forte. O gene kpsMTII foi amplificado apenas no grupo 1, sendo detectadas 44 amostras positivas (Tabela 2).
O gene fliC foi amplificado em 46 amostras do grupo 1 e em 45 amostras do grupo 2 (Tabela 2). Das 46 amostras fliC,29 expressaram motilidade em meio de cultura semi-sólido. No grupo 2, das 45 amostras positivas para o gene fliC, 42 amostras expressaram motilidade (Tabelas 3 e 4).
Os resultados dos ensaios de quantificação da formação de biofilme demonstraram que das 100 amostras de Escherichia coli estudadas, 44 amostras formaram biofilme em microplacas de poliestireno e 56 amostras apresentaram resultado ausente/fraco.
Neste trabalho, o gene fliC foi detectado em 47 amostras que formaram biofilme ausente/fraco, e em todas as amostras de biofilme moderado (36 amostras) e forte (8 amostras). Porém, a motilidade em meio semi-sólido foi observada em 37 amostras que apresentaram biofilme ausente/fraco, em 26 amostras que tinham biofilme moderado e em todas as oito amostras que formaram biofilme forte.
Foi observado que das 56 amostras que apresentaram resultado ausente/fraco, apenas oito amostras eram positivas para o gene flu. Das 36 amostras de biofilme moderado, 20 amostras tinham o gene flu e todas as oito amostras de biofilme forte eram positivas para o gene flu.
O estudo do agrupamento filogenético identificou que do total de 100 amostras estudadas, 34 (34%) amostras foram classificadas no grupo filogenético A, 4 (4%) amostras no grupo B1, 48 (48%) amostras no grupo B2 e 14 (14%) amostras no grupo D (Tabelas 3 e 4).
DISCUSSÃO
Os ensaios da PCR permitiram a caracterização molecular dos fatores de virulência associados à formação de biofilme e o agrupamento filogenético das 100 amostras de Escherichia coliestudadas. Foram realizados testes fenotípicos de quantificação de formação de biofilme em microplacas de poliestireno e testes de motilidade em tubos contendo meio de cultura semi-sólido para avaliar a formação de biofilme e motilidade.
Aproximadamente, 50% das infecções microbianas são associadas com formações de biofilme, que aumentam significantemente a resistência à antibióticos e aos mecanismos de defesa do sistema imune. Estudos têm demonstrado a importância da formação de biofilme bacteriano em ITUs, principalmente em cistite crônica e infecções associadas ao uso de cateteres6, uma vez que, a presença do biofilme atua na diminuição da susceptibilidade das bactérias aos agentes antimicrobianos quando comparados com culturas de crescimento em suspensão19. O crescimento do biofilme está associado ao aumento da resistência aos agentes antimicrobianos e à susceptibilidade a estes agentes são mil vezes maiores nas culturas que crescem em suspensão (planctônicas)6 19. Estudos sugerem que a resistência do biofilme é explicada pela impenetrabilidade dos agentes antimicrobianos devido à presença de um polímero hidrofílico que reveste o biofilme e a estratégias de liberação dos agentes antimicrobianos19.
Das adesinas afimbriais (antígeno 43), a família da proteína AT (autotransportadora) representa um novo grupo de fatores de virulência que estão envolvidas na adesão, invasão e formação do biofilme21. Estudos sugerem que o fenômeno de agregação mediado pelo ag43 poderia ser bloqueado pela expressão concomitante da fimbria do tipo 1, pois o contato célula-célula requerido pela adesina AT pode ser fisicamente bloqueado pela expressão de grandes estruturas extracelulares como fimbrias, flagelos, lipopolissacarídeo e cápsula9 21. Porém, neste trabalho, tanto o gene flu quanto a formação do biofilme em microplacas de poliestireno, foram detectados em maior prevalência nas amostras do grupo 1 que possuem tanto o gene para fímbria do tipo 1 quanto para fimbria P, e também a presença do polissacarídeo capsular, do que nas amostras do grupo 2 que apresentaram apenas 1 operon fimbrial estudado e ausência do antígeno capsular (Tabela 2).
O gene kpsMTII foi amplificado em 44 amostras do grupo 1, sendo que não foi encontrado em nenhuma amostra do grupo 2 (Tabela 1). Um estudo demonstrou que a cápsula pode bloquear a atividade de outras adesinas localizadas na superfície bacteriana, sugerindo que em bactérias onde não há expressão da cápsula há um aumento na formação do biofilme devido à expressão do antígeno 4314. Além disso, a função da fímbria do tipo 1 tem sido reportada por impedir a presença da cápsula na superfície bacteriana, e a síntese reduzida deste polissacarídeo pode aumentar a contribuição da fímbria para a formação do biofilme14. Neste trabalho, observamos que nas 50 amostras do grupo 2 positivas para a fímbria do tipo 1, nenhuma delas apresentavam o gene kpsMTII, demonstrando que nas 15 amostras que formaram biofilme em microplaca não houve participação da cápsula.
A motilidade tem papel essencial na formação do biofilme, provavelmente devido à superação da força de repulsão eletrostática das superfícies celulares, e por estar envolvida na colonização inicial da superfície celular do hospedeiro22 23. Foi demonstrado, que as diferenças na arquitetura da formação do biofilme, são causadas pela rotação flagelar ou pela presença da estrutura flagelar23 e que o flagelo é dispensável para formação de biofilme em amostras de Escherichia coli que expressam curli e em amostras que carregam o plasmídio conjugativo F22.
Das 46 amostras positivas para o gene fliC no grupo 1, 29 expressaram motilidade em meio de cultura semi-sólido. No grupo 2, das 45 amostras positivas para o gene fliC, 42 amostras expressaram motilidade (Tabelas 2 e 3). Estes resultados podem indicar que nas amostras do grupo 2, houve maior expressão de motilidade, pois encontram-se ausentes estruturas como cápsula ou adesinas.
O estudo do agrupamento filogenético identificou que do total de 100 amostras estudadas, 34 (34%) amostras foram classificadas no grupo filogenético A, 4 (4%) amostras no grupo B1, 48 (48%) amostras no grupo B2 e 14 (14%) amostras no grupo D (Tabelas 2 e 3). A prevalência do grupo filogenético B2 nas amostras papC positivas foi significativamente mais alto do que nas amostras papC negativas (Tabela 3 e 4). Estes resultados eram esperados uma vez que, amostras agrupadas nos grupos B2 e D, são conhecidas por possuir mais fatores de virulência e estão associadas a infecções extra-intestinais8 13 17.
Neste trabalho, observamos que o antígeno 43, responsável pela formação do biofilme, estava presente nas amostras que apresentaram formação de biofilme moderado e forte, além de poder estar associado a outros fatores de virulência na formação do biofilme em infecções urinárias, visto que houve maior prevalência deste gene no grupo de amostras que tinham a adesina P e o antígeno capsular. O gene fliC responsável pela motilidade foi encontrado em ambos os grupos, porém houve prevalência de expressão nas amostras do grupo 2. Estes dados sugerem que o flagelo pode estar associado a formação do biofilme na ausência de outras estruturas como as adesinas e a cápsula. Também confirmamos a incidência das amostras do grupo 1, no grupo filogenético B2 e D, uma vez que estas amostras possuem tanto a fímbria do tipo 1, quanto a fímbria P, característica de infecções extra-intestinais.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem o apoio financeiro da Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa concedida a Monique Ribeiro Tiba.
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Endereço para correspondência:
Dr. Domingos da Silva Leite
Laboratório de Antígenos Bacterianos II
Depto de Microbiologia e Imunologia, IB/UNICAMP
Cidade Universitária Zeferino Vaz
13081-970 Campinas, SP
Tel: 55 19 3521-6272
e-mail: domingos@unicamp.br
Recebido em:5/09/2008
Aceito em 09/12/2008
Apoio financeiro: Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (Processo 05/02473-4) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES.
