Cláudia Renata Bibiano BorgesI; Virmondes Rodrigues JuniorI; Marlene Antônia dos ReisII; Lúcio Roberto CastellanoI; Javier Emilio Lazo ChicaIII; Sanívia Aparecida de Lima PereiraIV; Edjane Souza SantosI; Denise Bertulucci Rocha RodriguesI,IV
ILaboratório de Imunologia, Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba, MG IIDisciplina de Patologia Geral, Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba, MG IIIDisciplina de Biologia Celular, Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba, MG IVUniversidade de Uberaba, Uberaba, MG
RESUMO
A doença de Chagas é causada pelo Trypanosoma cruzi e o coração é o órgão mais acometido. O óxido nítrico apresenta importante ação anti-Trypanosoma, porém, com pouca evidência de seu papel no mecanismo de lesão tecidual. O objetivo deste estudo foi analisar a contribuição do óxido nítrico no desenvolvimento da inflamação e da fibrose cardíaca na fase aguda da infecção experimental por cepas Y e Colombiana do Trypanosoma cruzi. A inflamação foi significativamente maior nos animais infectados pela cepa Colombiana, comparada com os infectados com a cepa Y, tanto nos animais C57BL/6 (3,98×1,87%; p=0,004) quanto nos animais C57BL/6 deficientes na sintase do óxido nítrico induzível (3,99×2,4%; p=0,013). O parasitismo cardíaco dos animais C57BL/6 deficientes na sintase do óxido nítrico induzível infectados pela cepa Colombiana foi significativamente maior que o destes mesmos animais infectados com a cepa Y (2,78×0,17 ninhos/mm2; p=0,004) assim como, os animais C57BL/6 infectados com a cepa Colombiana (2,78×1,33 ninhos/mm2; p=0,006) ou cepa Y (2,78×0,53 ninhos/mm2; p=0,005). Os dados reforçam o papel do óxido nítrico no controle do parasitismo e sugerem seu papel na proteção tecidual, controlando a inflamação e potencialmente diminuindo lesões cardíacas durante a fase aguda na doença de Chagas experimental.
Palavras-chaves: Doença de Chagas. Óxido nítrico. Inflamação. Fibrose.
ABSTRACT
Chagas disease is caused by Trypanosoma cruzi and the heart is the organ most affected. Nitric oxide has notable anti-Trypanosoma action, but with little evidence regarding its role in the mechanism for tissue injury. The objective of this study was to analyze the contribution of nitric oxide towards the development of inflammation and cardiac fibrosis during the acute phase of experimental infection by Y and Colombian strains of Trypanosoma cruzi. The inflammation was significantly more intense in animals infected with the Colombian strain, compared with those infected with the Y strain, both in C57BL/6 animals (3.98 vs 1.87%; p = 0.004) and in C57BL/6 animals deficient in inducible nitric oxide synthase (3.99 vs 2.4%; p = 0.013). The cardiac parasite load in inducible nitric oxide synthase-deficient C57BL/6 animals infected with the Colombian strain was significantly greater than in those infected with the Y strain (2.78 vs. 0.17 nests/mm2; p = 0.004), and also significantly greater than in the C57BL/6 infected with both the Colombian strain (2.78 vs 1.33 nests/mm2; p = 0.006) and Y strains (2.78 vs 0.53 nests/mm2; p = 0.005). The data confirm that nitric oxide has a role in parasite load control and suggest that it has a role in tissue protection, through controlling inflammation and potentially reducing cardiac lesions during the acute phase of Chagas disease.
Key-words: Chagas disease. Nitric oxide. Inflammation. Fibrosis.
A doença de Chagas possui caráter endêmico em largas extensões territoriais do continente americano e apesar dos recentes progressos no controle da doença, aproximadamente 20 milhões de pessoas ainda estão cronicamente infectadas1 2. A fase aguda, que pode ser ou não sintomática25, é seguida por um longo período de latência. O grau de comprometimento das células cardíacas varia desde formas discretas, assintomáticas até formas graves, eventualmente fatais18. Estudos demonstram que o infiltrado inflamatório parece ser mais lesivo para as fibras cardíacas do que para os próprios parasitas9 20 33. A patogênese da miocardite chagásica está diretamente relacionada com a presença do parasito e ao padrão de resposta imune do hospedeiro15 17 22 24. Na resposta inflamatória, o papel das citocinas na susceptibilidade e resistência à infecção pelo Trypanosoma cruzi ainda não foi totalmente elucidado. O interferon gama (IFN-γ ), é considerado uma citocina protetora, especialmente na fase aguda pela capacidade de ativar a expressão da sintase do óxido nítrico induzível7 26 32. Sozinho ou associado ao fator de necrose tumoral alfa (TNF-α ), o IFN-γ é um dos melhores indutores da atividade microbicida de macrófagos em várias infecções por parasitas intracelulares, incluindo Trypanosoma cruzi23 28 29 30. O óxido nítrico é uma importante molécula microbicida, sendo que camundongos deficientes em receptor de IFN-γ (IFN-γR-/-) ou deficientes na enzima sintase de óxido nítrico induzível apresentaram elevada susceptibilidade a infecção por Trypanosoma cruzi, com aumento da parasitemia e mortalidade durante a fase aguda16. Camundongos iNOS-/- apresentam dilatação ventricular progressiva e na disfunção sistólica durante miocardite aguda ocasionada pela cepa Tulahuen de Trypanosoma cruzi10. Por outro lado, estes mesmos animais apresentam menor desnervação do plexo mesentérico do esôfago após a infecção pela cepa Y5. O óxido nítrico apresenta ainda potencial imuno-regulatório e antifibrótico verificado na infecção experimental pelo Schistosoma mansoni14. Devido às suas diferentes propriedades, o óxido nítrico pode ter um papel importante no controle do parasita como também no desenvolvimento das lesões, assim neste trabalho analisamos a contribuição do óxido nítrico no controle do parasitismo, no desenvolvimento da inflamação e da fibrose cardíaca na fase aguda da infecção experimental por duas diferentes cepas do Trypanosoma cruzi.
MATERIAL E MÉTODOS
Animais e infecção. Foram analisados 24 camundongos, separados em 4 grupos de 6 animais: Grupo 1 (G1): linhagem C57BL/6 infectado com a cepa Y; Grupo 2 (G2): C57BL/6 infectado com a cepa Colombiana; Grupo 3 (G3): C57BL/6 iNOS-/- infectado com a cepa Y e Grupo 4 (G4): C57BL/6 iNOS-/- infectado com a cepa Colombiana. Os animais foram infectados com 3.000 formas tripomastigotas da cepa Y ou da cepa Colombiana do Trypanosoma cruzi por via intraperitoneal. A eutanásia foi realizada no 15º dia após a inoculação, através do deslocamento cervical e posterior autópsia, com incisão ventral, para a retirada do coração. Os animais foram mantidos e eutanasiados seguindo as recomendações do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA)12 21.
Processamento das lâminas. Os fragmentos do coração foram processados e as lâminas confeccionadas e submetidas às colorações por HE para quantificação do infiltrado inflamatório, por picrosírius para avaliação morfométrica do tecido conjuntivo fibroso. Ainda, lâminas foram utilizadas na técnica de imunohistoquímica para detecção dos ninhos de Trypanosoma cruzi, utilizando soro de coelho antiTrypanosoma cruzi.
Quantificação do infiltrado inflamatório e densidade parasitária. Para quantificação do infiltrado inflamatório, as imagens foram capturadas, analisadas no programa Image J (NIH, BETHESDA, USA) e calibradas através da lâmina (Leica) com régua graduada em dois milímetros divididos em unidades de 0,01mm (dez micrômetros) na objetiva de 10x. Foi utilizado um sistema teste de contagem de pontos em uma área teste pré-determinada19. Para calcular o número de áreas teste ou campos, foi utilizada a fórmula de Hally13. Para análise da miocardite, empregou-se o critério de Dallas6.
A densidade parasitária do número de ninhos de amastigotas por mm2 foi realizada através da contagem desses ninhos em todo o corte do coração de cada animal. A quantificação da área do miocárdio foi realizada capturando toda a imagem do coração com o auxílio de um scanner HP Scanjet G 4050 (USA) e o programa Adobe Photoshop CS2. O tamanho de cada imagem corresponde a 10mm2. As imagens foram analisadas usando o software Image J, e os valores expressos em ninhos/mm2.
Quantificação da fibrose. A morfometria foi feita utilizando o Sistema Analisador de Imagem Automático KS 300 (Carl Zeiss, Alemanha). O campo a ser quantificado foi capturado por meio de uma câmera acoplada ao microscópio e ao computador para digitalização da imagem. Na imagem polarizada o tecido conjuntivo fibroso apresentou-se birrefringente sendo marcado pelo observador, obtendo assim o percentual de fibrose por área analisada. A análise foi realizada em todos os campos do fragmento, totalizando 20 campos8.
Detecção de ninhos de Trypanosoma cruzi. A imunohistoquímica para detecção de ninhos de Trypanosoma cruzi foi realizada nos cortes de coração fixados em formol. Após bloqueio da peroxidase endógena as lâminas foram incubadas com o anticorpo antiTrypanosoma cruziproduzido em coelho (1:250), durante 2 horas à temperatura ambiente (37ºC). Posteriormente, as lâminas foram incubadas com a proteína A conjugada com peroxidase (1:500) e reveladas com H2O2-0,05% + DAB-diaminobenzidina, em tampão tris-HCl pH 7,4. Os cortes foram contracorados com hematoxilina e as lâminas foram então montadas para análise em microscópio de luz comum8.
Análise estatística. A análise estatística foi realizada através do programa Statview (Abaccus, EUA). As variáveis apresentaram distribuição não normal e foram analisadas pelo teste de Mann-Whitney (T) para comparação de dois grupos independentes. Para as correlações entre as variáveis estudadas foi utilizado o Coeficiente de Correlação de Spearman. Os resultados foram considerados significativos quando a probabilidade foi menor que 5% (p<0,05).
RESULTADOS
O processo inflamatório foi avaliado por morfometria utilizando um sistema teste de contagem de pontos em uma área teste pré-determinada, na fase aguda no miocárdio dos animais infectados com as cepas Y e Colombiana. Não houve diferença significativa entre os animais C57BL/6 e C57BL/6 iNOS-/- quando infectados pela cepa Y (1,87 e 2,4 %, respectivamente) ou Colombiana (3,98 e 3,99 %, respectivamente). Entretanto, em ambas as linhagens, quando comparados os animais infectados com as cepas Y e Colombiana, no grupo C57BL/6 iNOS-/- a inflamação causada pela cepa Colombiana foi significativamente maior (3,99 e 2,4 %, respectivamente; p=0,013) assim como, no grupo C57BL/6 (3,98 e 1,87 %, respectivamente; p=0,004) (Figura 1). O número de ninhos de Trypanosoma cruzi no tecido cardíaco nos animais infectados com a cepa Colombiana foi significativamente maior nos animais C57BL/6 iNOS-/- que nos C57BL/6 selvagens (2,78 e 1,33 ninhos/mm2, respectivamente; p=0,006), enquanto nos animais infectados com a cepa Y não foi observado diferença significativa entre estes grupos (Figura 2). Nos animais C57BL/6 iNOS-/-infectados com a cepa Colombiana, o número de ninhos foi significativamente maior que nos animais C57BL/6 selvagens e C57BL/6 iNOS-/- infectados com a cepa Y (2,78 e 0,53 ninhos/mm2; p=0,005 e 2,78 e 0,17 ninhos/mm2; p=0,004, respectivamente). A linhagem C57BL/6 não houve diferença significativa quando comparada as duas cepas de Trypanosoma cruzi (Figura 2). Ainda, observamos uma correlação positiva e significativa quando comparamos em ambas as cepas e linhagens, a porcentagem de infiltrado inflamatório com o número de ninhos de amastigotas/mm2(rS=0,002) (Figura 3). No entanto, embora a correlação entre a porcentagem de infiltrado inflamatório e de fibrose/mm2 também tenha sido positiva, essa diferença não foi significativa (Figura 4). Também não houve diferença significativa na intensidade da fibrose entre os grupos estudados (Figura 5).
DISCUSSÃO
Nossos resultados apontam que o número de ninhos de Trypanosoma cruzi no tecido cardíaco nos animais infectados com a cepa Colombiana foi significativamente maior nos animais C57BL/6 iNOS-/- que nos animais C57BL/6 devido a sua deficiência de produção de óxido nítrico, uma importante molécula tripanocida11 30. Comparando os animais C57BL/6 iNOS-/- com as duas cepas, os animais infectados com a cepa Colombiana, apresentaram números de ninhos significativamente maiores que os infectados com a cepa Y. Esses resultados se justificam, uma vez que a cepa Colombiana apresenta nítido miotropismo, sobretudo com envolvimento de musculatura esquelética4. Já a cepa Y é caracterizada por uma infecção de evolução rápida, e com altos níveis de parasitemia e apresenta tropismo por macrófagos3. Os animais da linhagem C57BL/6, em nossos resultados, apresentaram um padrão de resistência à infecção pelo Trypanosoma cruzi em relação aos C57BL/6 iNOS-/-.. Animais C57BL/6 têm sido apontados como resistentes a parasitas intracelulares, como Trypanosoma cruzi e Leishmania sp apresentando capacidade de gerar uma resposta imune predominante de padrão Th1 capaz de estimular o macrófago a eliminar parasitas intracelulares27.
No presente trabalho, comparando a inflamação durante a fase aguda entre os grupos de animais C57BL/6 e C57BL/6 iNOS-/- infectados com a cepa Colombiana e com a cepa Y não houve diferença significativa. No entanto, em cada uma das linhagens, quando comparados os animais infectados com as duas cepas, no grupo C57BL/6 iNOS-/- a inflamação causada pela cepa Colombiana foi significativamente maior que a causada pela cepa Y. Encontramos uma correlação positiva e significativa entre o aumento do infiltrado inflamatório e o número de parasitas encontrados nos tecidos analisados, muito provavelmente devido à cepa Colombiana apresentar miotropismo e induzir inflamação com maior intensidade4. Já quando analisamos a fibrose, observamos uma correlação positiva, mas não significativa entre essa variável e o infiltrado inflamatório. Neste estudo, quando comparados os animais C57BL/6 e C57BL/6 iNOS-/-, nas duas cepas, não houve diferença significativa, embora fosse observado que os animais C57BL/6 iNOS-/-apresentaram uma maior área de tecido conjuntivo fibroso quando infectados pela cepa Colombiana. Em modelo de fibrose induzida pela infecção experimental pelo Schistosoma mansoni, foi demonstrado que a sintase do óxido nítrico induzível é responsável pelos efeitos antiinflamatórios e anti-fibróticos atribuídos a uma resposta Th114. Animais deficientes em sintase do óxido nítrico induzível apresentaram maior inflamação, provavelmente devido ao maior parasitismo tissular, sugerindo que a inflamação da fase aguda é dependente e proporcional ao parasitismo tissular31. Não foi observada neste estudo, diferença na fibrose entre os animais deficientes e sintase do óxido nítrico induzível e seu homólogos selvagens sugerindo que na doença de Chagas, o óxido nítrico não está envolvido na formação precoce da fibrose cardíaca.
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Endereço para correspondência:
Profa. Denise Bertulucci Rocha Rodrigues
Laboratório de Imunologia/UFTM
Av. Getúlio Guaritá s/n
38025-180 Uberaba, MG
Tel: 55 34 3318-5289
e-mail: denise.rodrigues@uniube.br
Recebido para publicação em 01/12/2008
Aceito em 20/03/2009
Apoio Financeiro: FAPEMIG, CNPq, CAPES, FUNEPU.
