Jaqueline Otero SilvaI; Joseane Cristina FerreiraII; Regina Célia CandidoII
ILaboratório I de Ribeirão Preto, Instituto Adolfo Lutz, Ribeirão Preto, SP IIDepartamento de Análises Clínicas, Bromatológicas e Toxicológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP
RESUMO
A habilidade de Candida spp secretar enzimas extracelulares e slime tem sido associada como fatores de patogenicidade. Do total de 37 cepas de Candida sp, 100% foram produtoras de proteinase, 83,8% fosfolipase, 64,9% slime e 100% sensíveis ao fluconazol e itraconazol. Foram encontradas 17 tipagens (enzima/slime). Esta metodologia apresentou um bom índice discriminatório (D=0,93) podendo ser utilizado na caracterização fenotípica das leveduras.
Palavras-chaves: Antifúngicos. Candida sp. Fosfolipase. Proteinase. Slime.
ABSTRACT
Abilith of Candida spp to secrete extracellular enzymes and slime has been associated as pathogenicity factors. Out of a total of 37 strains of Candida sp, 100% were proteinase producers, 83.8% were phospholipase producers, 64.9% were slime producers and 100% were sensitive to fluconazole and itraconazole. Seventeen typings (enzymes/slime) were found. This methodology presented a good discrimination rate (D = 0.93) and could be used for phenotypic characterization of yeasts.
Key-words: Antifungal agents. Candida sp. Phospholipase. Proteinase. Slime.
Entre os fungos, Candida sp é o gênero predominante na microbiota humana sendo, Candida albicans a espécie mais freqüente.
Em Candida albicans, a formação do tubo germinativo com conseqüente desenvolvimento da forma filamentosa, a variabilidade fenotípica (switching), a produção de toxinas, a aderência à superfície celular e a produção de enzimas extracelulares, constituem os fatores que contribuem para o desencadeamento da infecção por este patógeno2.
Os testes de sensibilidade aos antifúngicos vêm sendo desenvolvidos gradativamente nos últimos anos, devido ao aparecimento de cepas resistentes in vivo e in vitro5.
O presente estudo tem como objetivo verificar a produção de proteinase, fosfolipase e slime de Candida sp isoladas de diferentes sítios corpóreos do homem e ainda verificar o perfil de sensibilidade às drogas fluconazol e itraconazol.
Organismos testados. Selecionou-se para investigação 37 leveduras sendo, 31 Candida albicanse 6 Candida parapsilosis obtidas de amostras biológicas de diferentes sítios anatômicos (fezes, vagina e boca) de 17 pacientes voluntários e atendidos através do Sistema de Saúde Integral da Universidade de São Paulo de Ribeirão Preto.
Pesquisa de proteinase e fosfolipase. O estudo da proteinase foi realizado segundo a metodologia descrita por Ruchel cols8 e o estudo da fosfolipase, segundo Prince cols7, sendo as leituras realizadas após 7 e 5 dias, respectivamente. A presença da atividade da proteinase foi verificada pela formação de um halo transparente e de fosfolipase pela formação de um halo opaco ao redor da colônia. A atividade enzimática de ambas as enzimas foi medida de acordo com a técnica de Prince cols7 através do valor da zona de precipitação (PZ). Para tanto, as atividades enzimáticas PZ foram medidas dividindo-se o diâmetro da colônia pelo diâmetro da colônia somado à zona de precipitação. Os resultados foram apresentados em código sendo o valor 1 quando PZ=1,0 (sem atividade enzimática), valor 2 quando 0,63 <PZ<1,0 (atividade enzimática moderada) e valor 3 quando PZ<0,63 (forte atividade enzimática).
Produção de slime. Foi realizado o método qualitativo em tubo de acordo com a técnica descrita por Christensen cols3 e modificada segundo Ozkan cols6, 200513. Considerou-se aderência negativa (código=0), fracamente positiva (código=1), moderadamente positiva (código=2) ou fortemente positiva (código =3).
Tipagem (enzima/slime). Foi codificada com algarismos contendo 3 dígitos. O primeiro representando a fosfolipase, o segundo a proteinase e o terceiro a produção de slime. O índice de diversidade (D) da metologia foi realizada de acordo com Hunter e Gaston4.
Teste de sensibilidade. As leveduras foram avaliadas quanto à sensibilidade ao fluconazol com concentrações testes variando de 64 a 0.25µg/mL (Pfizer, Sandwich, UK) e itraconazol com concentrações variando de 16 a 0.03µg/mL (Jansen, Reerse, Belgium). O teste foi realizado pela técnica de microdiluição em caldo, segundo documento do National Committee Clinical Laboratory Standarts (NCCLS) M27-A2, 20025 utilizando como cepa controle Candida parapsilosis ATCC 22019.
A Tabela 1 mostra que 100% das cepas de Cândida albicans produziram as enzimas proteinase e fosfolipase sendo que, 68,8% e 32,3% apresentaram forte atividade para as respectivas enzimas. Estes resultados estão dentro dos parâmetros encontrados na literatura1 9.
Não foram encontradas cepas de Candida parapsilosis produtoras de fosfolipase corroborando com os resultados de Candido cols1. No entanto, Shimizu9 verificou atividade de fosfolipase em Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Candida guilhiermondii e Candida krusei.
Quanto à produção de slime, 35,1% foram negativas, 35,1% fracamente positivas, 8,1% moderadamente positivas e 21,6% fortemente positivas. Todos os isolados de Candida parapsilosisproduziram este fator de patogenicidade (Tabela 1). Ozkan cols13 encontraram em cepas provenientes de sangue, 80,5% de produção de slime sendo que 89,4% das Candida parapsilosisapresentaram esta atividade
Todas as leveduras foram sensíveis aos antifúngicos fluconazol e itraconazol apresentando concentrações inibitórias mínimas que variaram de 0,125 a 0,5 e de 0,03 a 0,06, respectivamente. Não encontramos correlação entre atividade de slime e resistência aos antifúngicos testados corroborando com resultados de Ozkan cols6. Yücesoy cols10 ao investigar a produção de biofilme de várias cepas de Candida encontraram diferenças significativas entre atividade biofilme e sensibilidade ao fluconazol.
A Tabela 1 mostra a diversidade fenotípica, representada pelo encontro de 17 diferentes tipagens (enzimalslime), sugerindo ocorrer uma facilidade de adaptação das cepas nas diferentes localizações anatômicas. No entanto, 5 pacientes apresentaram cepas com o mesmo perfil (enzima/slime) em diferentes localizações. Esta metodologia apresentou um bom índice de diversidade (D=0,93) podendo ser utilizado na caracterização fenotípica das leveduras e, portanto, servir como um marcador epidemiológico de infecções por Candida.
REFERÊNCIAS
1. Candido RC, Azevedo RVP, Komesu MC. Enzimotipagem de espécies do gênero Candida isoladas da cavidade bucal. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 33: 437-442, 2000. [ Links ]
2. Chakrabarti A, Navak N, Talwar P. In vitro proteinases production by Candida species. Mycopathologia 114:163-168, 1991. [ Links ]
3. Christensen GD, Simpson A, Bisno AL, Beachey EH. Adherence of slime-producing strains of Staphylococcus epidermidis to smooth surfaces. Infection and Immunith 37: 318-326, 1982. [ Links ]
4. Hunter PH, Gaston MA. Numerical index of the discrimination abiliyh of typing systems: na application of Simpson’s index of diversity. Jounal of Clinical Microbiology 26: 2465-2466, 1998. [ Links ]
5. National Committee Clinical Laboratory Standarts (NCCLS). Reference method for broth diluition antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved Standard. NCCLS document M27-A2, Wayne, PA, 2002. [ Links ]
6. Ozkan S, Kaynak F, Kalkanei A, Abbasoglu U, Kustimu S. Slime production and proteinase activith of Candida species isolated from blood samples and the comparison of these activities with minimun inhibitory concentration values of antifungal agents. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 100: 319-324, 2005. [ Links ]
7. Prince MF, Wilkinson ID, Gentry LO. Plate methodas for detection of phospholipase activity in Candida albicans. Sabouraudia 20:7-14, 1982 [ Links ]
8. Ruchel R, Tegeler R, Trost M. A comparison of secretory proteinase from different strais of Candida albicans. Sabouraudia 20: 233-244, 1982. [ Links ]
9. Shimizu MT. Fosfolipase em espécies de Candida. Revista de Microbiologia 20: 338, 1989. [ Links ]
10. Yücesoy M, Karaman M. Candida türlerinin biyofilm üretimi ve antifungal duyarlylyk paternleri. Ulusal Mantar Hastaliklari ve Klinik Mikoloji Kongresi 24: 360, 2003. [ Links ]
Endereço para correspondência:
Dra Jaqueline Otero Silva
Rua Minas 877, Campos Elíseos
14085-410 Ribeirão Preto, SP
Tel: 55 16 3625-5046; Fax 55 16 3635-7994
e-mail: jaquelineos@ig.com.br
Recebido para publicação em 2/8/2006
Aceito em 19/3/2007
