Natércia Emília Pedro FernandesI; Pedro CravoII; Virgílio E. do RosárioII
IDepartamento de Pediatria, Universidade Eduardo Mondlane - Faculdade de Medicina. Maputo, Moçambique IIUnidade de Ensino e Investigação de Malária, Centro de Malária e Outras Doenças Tropicais, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade Nova de Lisboa, Lisboa, Portugal
RESUMO
Foram analisadas a freqüência e distribuição de mutações nos genes dihidrofolato redutase e dihidropteroato sintetase do Plasmodium falciparum, usando a metodologia de reação em cadeia da polimerase e polimorfismos de hidrólise por enzimas de restrição, em amostras de sangue infectado proveniente de crianças moçambicanas, residentes em Maputo. A análise foi feita antes e 7 dias após o tratamento com sulfadoxina-pirimetamina (S/P). Os resultados mostraram a ocorrência de mutações pontuais nos genes estudados e a presença de combinações de três alelos em dhfr (51Ile, 59Arg e 108Asn) e do quintúplo mutante (dhfr 51Ile, 59Arg, 108Asn e dhps 437Gly, 540Glu), ambas situações associadas à falha terapêutica no sétimo dia após tratamento com S/P. Esses achados mostram a importância de se estudar a resistência à S/P em Moçambique, e como os marcadores moleculares de resistência aos antimaláricos podem fornecer dados importantes para a política nacional de controlo da malária.
Palavras-chaves: Dihidrofolato redutase. Dihidropteroato sintetase. Resistência. Sulfadoxina/pirimetamina. Moçambique.
ABSTRACT
The frequency and distribution of mutations in Plasmodium falciparum, dihydrofolate reductase and dihydropteroate synthase genes were analyzed, using the polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism methodology, in infected blood samples from Mozambican children living in Maputo, before and seven days after treatment with sulfadoxine/pyrimethamine (S/P). The results showed the occurrence of point mutations in the genes studied and the presence of combinations of three alleles in dhfr (51Ile, 59Arg and 108Asn) and “quintuple” mutant (dhfr 51Ile, 59Arg, 108Asn and dhps 437Gly, 540Glu). Both of these situations were associated with seven-day therapeutic failure, following treatment with S/P. These findings show the importance of studying S/P resistance in Mozambique, and how molecular markers for antimalarial resistance can provide important data for national malaria control policy.
Key-words: Dihydrofolate reductase. Dihydropteroate synthase. Resistance. Sulfadoxine/pyrimethamine. Mozambique.
A resistência farmacológica do Plasmodium falciparum é um dos principais problemas nos programas de controle da malária. Nas últimas décadas, o crescente aumento da resistência à cloroquina levou a introdução de outros antimaláricos (ex: pirimetamina), bem como a modificação de esquemas terapêuticos já existentes ou inclusão de medicamentos já conhecidos e em novas associações. Contudo, o tratamento da malária com alguns desses medicamentos tem sido comprometido pelo aparecimento de parasitas resistentes21. Nas áreas endêmicas, da África, das quatro espécies de Plasmodium que infectam o Homem, a espécie Plasmodium falciparum é a que apresenta maior prevalência e virulência. Esta espécie rapidamente desenvolveu resistência à maioria dos antimaláricos atualmente em uso tomando proporções alarmantes na saúde pública1 2. Maputo é a capital de Moçambique, um País onde a malária é endêmica todo ano, atingindo o seu ponto mais alto após a época chuvosa (dezembro a abril). Com uma intensidade de transmissão variável, que depende da precipitação, altitude e temperaturas, o Plasmodium falciparum é o parasita mais prevalente, sendo responsável por cerca de 90% de todas infecções3. Os primeiros registros de resistência à cloroquina datam de 19834 e, nos últimos anos, tem sido realizadas várias investigações relacionadas com resistência e este e outros antimaláricos na região5 6 7.
A resistência à sulfadoxina/pirimetamina (S/P) surge pela presença de mutações pontuais nas regiões codificantes do centro ativo da enzima bifuncional dihidrofolato reductase (dhfr)-timidilato sintetase (ts) e da enzima dihidropteroato sintetase (dhps), para a pirimetamina e sulfadoxina respectivamente8 9 10 11 12. Para a pirimetamina, geralmente a mutação no gene dhfr no códon 108, alteração de uma serina para uma asparagina, parece ser suficiente para conferir resistência a este medicamento e conseqüentemente à sulfadoxina/pirimetamina14. Este fato, explica a razão pela qual a resistência do parasita tenha surgido imediatamente após a generalização do uso deste fármaco como terapêutica da malária10. Para além da mutação 108Asn, mutações nos códons 51 e 59, substituição da asparagina por isoleucina e cisteína por arginina, respectivamente, encontram-se normalmente implicadas nos elevados níveis de resistência a este fármaco8 9. Investigações realizadas10 11 13 demonstraram que, para o gene dhps, mutações pontuais nos codons 436 (serina 
alanina), 437 (alanina glicina), 540 (lisina glutamato) e 613 (treonina serina), estão associadas a resistência à sulfadoxina. Outros estudos, mostraram também que o conjunto de três mutações no gene dhfr (51Ile, 59Arg e 108Asn) e duas no gene dhps (437Gly e 540Glu), designado quíntuplo mutant, é considerado como um marcador molecular para a falha terapêutica, observado no tratamento de Plasmodium falciparum com S/P15 16. Foi objetivo do presente estudo identificar a freqüência e distribuição das mutações pontuais nos genes dhfr e dhps do Plasmodium falciparum, em crianças moçambicanas residentes em Maputo.
MATERIAL E MÉTODOS
O estudo teve lugar de agosto a outubro de 2004, no Centro de Saúde de Bagamoyo em Maputo, Moçambique, onde foram envolvidas todas as crianças (dos 6 meses aos 5 anos) com malária não complicada. Os critérios de inclusão consistiram na presença de monoinfeccão com a espécie Plasmodium falciparum, não ingestão de antimaláricos nas 3 semanas anteriores, ausência de história de alergia às sulfonamidas e consentimento informado dos pais ou responsáveis pela criança. O estudo foi revisto e aprovado pelo Comité Nacional de Bioética para a Saúde.
Colheita de amostras. No total foram colhidas 148 amostras (74 antes e 74 após o tratamento com S/P). Na primeira visita da criança ao Centro de Saúde (designado de dia 0) foram obtidas, por punção digital, duas gotas de sangue sendo uma colhida diretamente numa lâmina e a outra em papel de filtro Whatman (Maidstone, United Kingdom) 3MM, que foi deixado a secar a temperatura ambiente. Após secas, as amostras colhidas em papel de filtro foram devidamente acondicionadas e transportadas para o laboratório do Instituto de Higiene e Medicina Tropical em Lisboa, Portugal, para análise molecular.
Identificação parasitária. Do sangue colhido, nas lâminas, foi realizada uma gota espessa e um esfregaço que, após corados com a solução de Giemsa a 15%, foram observados por microscopia óptica para a determinação da espécie de Plasmodium infectante e a respectiva parasitemia23.
Tratamento dos pacientes. Todas as crianças envolvidas do estudo foram tratadas, na unidade sanitária e sob supervisão médica, com uma dose única de Fansidar (25mg/kg de sulfadoxina e 1,25mg/kg de pirimetamina), no dia 0 e observadas sete dias após o tratamento (designado dia controle ou dia 7), para a verificação da cura (clínica e parasitológica) ou, em caso de sintomas, antes da data prevista do controle.
Extração do ácido desoxirribonucléico. Do sangue colhido em papel de filtro foi extraído o ácido desoxiribonucléico (DNA), utilizando o método de Chelex-10017.
Reação em cadeia da polimerase e polimorfismos de hidrólise por enzimas de restrição. Para a amplificação do ácido desoxiribonucléico parasitário, utilizou-se o método de reação em cadeia da polimerase (PCR), descrito por Duraisingh18. Para obtenção dos e polimorfismos de hidrólise por enzimas de restrição (PHER), dependendo da intensidade das bandas de electroforese no gel, usaram-se 2-5µl de produto amplificado da segunda reacção de PCR em cada incubação com diferentes enzimas de restrição, de acordo com as instruções do fabricante (New England Biolabs, Beverly MA, USA). Para a identificação das mutações no gene dhfr utilizaram-se, para códons 51 e 59, as enzimas TasI e PdmI respectivamente e, para o códon 108 as enzimas de restrição AluI, Bsenl e Bstnl. Para o gene dhps, as enzimas HpyF10VI e BSeGI foram utilizadas para a identificação das mutações nos códons 437 e 540, respectivamente. Como controle do PCR e do PHER utilizou-se DNA de amostras de Plasmodium falciparum orginárias de diferentes áreas, nomeadamente as linhagens: STP79 (São Tomé e Príncipe), Dd2 (Vietname), Hb3 (Honduras), T9/94 (Tanzânia) e K1 (Tailândia). Todos os produtos de PCR e PHER foram separados em electroforese de géis de agarose (1% Seaken e 1% NuSieve) e a sua visualização efectuada num transiluminador de luz ultravioleta, após coloração dos géis com brometo de etídio (6mg/ml). A análise estatística foi feita pelo F-test e Chi-square test, com nível de significância estatística de 5%.
RESULTADOS
De um total de 148 amostras colhidas (74 antes e 74 depois do tratamento com S/P), todas (100%) apresentavam-se positivas para Plasmodium falciparum antes do tratamento (D0), tanto na análise por microscopia óptica (MO) como pela reação em cadeia da polimerase. No dia do controle (D7), após o tratamento com S/P, 28 amostras (38%) continuavam positivas, na análise por MO e 73 (98%) na análise pela reação em cadeia da polimerase. Na análise dos polimorfismos, nos genes dhfr e dhps, 72 amostras apresentavam polimorfismos em D0 e 71 amostras em D7. No gene dhfr, a mutação 108 Asn foi encontrada em sessenta e nove (95,8%) das 72 amostras analisadas em D0, e em sessenta e oito (95,7%) das 71 amostras analisadas em D7 (Tabela 1). Dessas sessenta e nove amostras com a mutação 108Asn, sessenta e duas (89,8%) tinham esta mutação associada às mutações 51Ile e 59Arg antes e, 63 (91,3%) após o tratamento com S/P. Não foram observadas mutações isoladas. Mutações triplas em dhfr, posições 51, 59 e 108, e quíntuplas em dhfr posições 51, 59, 108 e em dhps 437, 540, respectivamente, foram as mais freqüentes, tendo estas últimas aumentado de 34 (47,2%) para 48 (67,6%), p = 0,014, após o tratamento com S/P (Tabela 2). Nas duas regiões estudadas do gene dhps (códons 437 e 540), foram encontradas mutações pontuais estando a maior parte associadas às mutações no gene dhfr. Em apenas quatro amostras (duas de D0 e duas de D7), foram identificadas mutações somente no gene dhps (Tabela 2).
DISCUSSÃO
Estudos de biologia molecular na investigação dos mecanismos moleculares de quimiorresistência parasitária são relevantes no combate à malária, sobretudo a causada por Plasmodium falciparum,uma vez que não só permitem uma identificação racional de novos alvos terapêuticos, como também o estabelecimento de novos métodos de identificação/diagnósticos da resistência aos antimaláricos. Apesar de dispendiosa, a utilização da técnica de reação em cadeia da polimerase seguida de hidrólise enzimática, permite, de uma maneira específica e sensível, separar os parasitas sensíveis dos resistentes. No presente estudo, para identificação da espécie de Plasmodium, a técnica de reação em cadeia da polimerase mostrou ter maior sensibilidade em relação à análise por microscopia óptica. Foram identificadas, antes do tratamento, 95,8% das amostras com a mutação 108Asn, descrita como a mutação precursora para o surgimento de todas as linhagens resistentes à pirimetamina14 19 21. Este dado indica a existência desta mutação em circulação na população do estudo. Observamos também que sete dias após o tratamento com S/P, esta mutação permanecia elevada (95,7%), o que nos permite colocar a hipótese de que este medicamento provavelmente não estará a funcionar na área do estudo. Por outro lado, foram identificadas amostras com associação da mutação dhfr 108Asn com as mutações dhfr 51Ile e 59Arg, padrão este implicado com o aumento progressivo dos níveis de resistência farmacológica a este fármaco19. No presente estudo, foi também analisado o gene dhps, onde identificaram-se mutações pontuais nas duas regiões estudadas deste gene (437gly e 540glu), estando a maioria associadas às mutações no gene dhfr (Tabela 2). Em relação presença de três mutações no gene dhfr (51Ile, 59Arg e 108Asn), antes e após o tratamento, apesar dos resultados não mostrarem significância estatística, está descrito que a associação destas está implicada num maior aumento de resistência ao tratamento com S/P20 22. O quíntuplo mutante, considerado como sendo um marcador molecular de falha terapêutica ao tratamento da malária, por Plasmodium falciparum, com S/P15 16, mostrou ter sofrido um aumento estatisticamente significativo após o tratamento, levando-nos a colocar a hipótese de seleção de alelos mutantes. O presente estudo confirma o envolvimento das mutações, nos genes dhfr e dhps de Plasmodiu falciparum, na falha terapêutica ao sétimo dia no tratamento da malária com S/P em Maputo, Moçambique, refletindo provavelmente a pressão deste medicamento no país durante vários anos.
Sendo a resistência aos antimaláricos um dos principais obstáculos aos programas de controlo da malária, torna-se importante que para além de um diagnóstico rápido e eficiente, se possa também determinar a prevalência da resistência aos antimaláricos com a identificação de marcadores moleculares de resistência, possibilitando a modificação, pelas autoridades sanitárias locais, dos esquemas terapêuticos e/ou profiláticos em uso nessa região, de modo a atuar mais eficazmente contra a malária.
AGRADECIMENTOS
Aos pacientes que concordaram em participar no estudo (Moçambique) e ao laboratório do Centro de Malária e outras Doenças Tropicais do Instituto de Higiene e Medicina Tropical (Portugal).
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Endereço para correspondência:
Drª Natércia Emília Pedro Fernandes
Faculdade de Medicina/Universidade Eduardo Mondlane
Av. Salvador Allende. Caixa Postal 257, Maputo, Moçambique
Tel: + 258 82 306-6420; Fax: +258 21 49-5046/42-5255
e-mail: naterciaf@yahoo.com.br
Recebido em: 06/02/2006
Aceito em: 11/07/2007
O trabalho foi financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (SFRH/BD/10100/2002)-Portugal.
