Carlos T. BrandtI; Carlos Roberto C. LeiteI; Raul Manhaes-de-CastroIV; Carlos Brandt FilhoIII; Francisco M. Manhaes-de-CastroIII; Celia Maria M. Barbosa-de-CastroII
IDepartamento de Cirurgia da Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE IIDepartamento de Medicina Tropical e Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami da Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE IIIFaculdade de Medicina da Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE IVDepartamento de Nutrição da Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE
RESUMO
Investigamos em portadores de esquistossomose hepatoesplênica após esplenectomia com ou sem auto-implante esplênico: índice de aderência, produção de superóxido (SP) e de TNF-a em monócitos, tratados ou não com tuftsina. Avaliamos três grupos: voluntários sadios CG (grupo controle) (n=12); esplenectomizados com auto-implante AG (n=18) e esplenectomizados sem auto-implante WAG (n=9). Índice de aderência e TNF-a não diferiram entre os grupos. SP foi semelhante em CG e AG na 1ª hora após estimulação celular. SP foi maior em todos intervalos de tempo nos grupos CG e AG, comparados ao WAG. O tratamento com tuftsina recuperou o padrão de normalidade de SP em AG, com aumento da 1ª para a 2ª hora nos níveis do CG. O tratamento com tuftsina não alterou SP em WAG, permanecendo reduzida em todos intervalos. O auto-implante esplênico parece recuperar e manter os parâmetros imunológicos avaliados, que têm participação importante na resposta do hospedeiro às infecções.
Palavras-chaves: Auto-implante. Esquistossomose hepatoesplênica. Índice de aderência. Superóxido. Fator de necrose tumoral-a.
ABSTRACT
Adherence index, superoxide and TNF-a production in monocytes, with or without tuftsin treatment, were investigated in hepatosplenic schistosomiasis mansoni bearers with splenectomy with or without autologous implantation of spleen tissue. Three groups were evaluated: Healthy volunteers control group (CG) (n=12); Splenectomy with seft auto-transplant AG (n=18) and Splenectomy without auto-transplant WAG (n=9). Adherence index and TNF-a did not differ among the groups. Superoxide production was similar in CG and AG, in the 1st hour after cell stimulation. SP was larger in each hour time in CG and AG groups as compared WAS group. TT recovered normal pattern of SP in AG comparable with levels found in CG, with increase from the 1st to 2ndhour. However, TT did not alter SP in WAG, which remained reduced in all time points. Autologous implantation of spleen tissue seems to contribute for recovery and maintenance of the evaluated immunological reactions, which might be important in response to infections.
Key-words: Autologous implantation. Hepatosplenic schistosomiasis. Adherence index. Superoxide production. TNF-a.
O Schistosoma mansoni infeta cerca de 200 milhões de pessoas no mundo, 120 milhões evoluem com sintomas e 20 milhões apresentam com dano hepatoesplênico13. No Nordeste do Brasil, a esquistossomose mansônica é hiperendêmica sendo a causa principal de hipertensão portal em crianças3. A maioria destas é tratada clinicamente, todavia, algumas requerem cirurgia, sendo a esplenectomia freqüente nesta região5. O baço é o maior órgão linfóide do organismo e principal local de resposta imune a antígenos presentes no sangue. A complicação mais temida é a sepse fulminante pós-esplenectomia, por bactérias encapsuladas, cuja mortalidade é de 50 a 75%14. Isto tem sido atribuído à deficiência de fagócitos (neutrófilos, monócitos e macrófagos), responsáveis pela destruição das bactérias25. O auto-implante de tecido esplênico no grande omento é a forma mais aceitável de preservar a função esplênica11 17, reduzindo a sepse pós-esplenectomia 5.
Os fagócitos produzem citocinas pró-inflamatórias, particularmente, o Fator de Necrose Tumoral-a(TNF-a) e ativa a resposta imune adaptativa6. A capacidade dos fagócitos em aderir in vitro a certos substratos é conhecida de longa data23. A adesão é a primeira etapa no processo fagocítico e é essencial para a resposta inflamatória8 25. Ademais, os fagócitos liberam derivados bactericidas do oxigênio, e o ânion superóxido (O2–)16. Indivíduos cujas células são incapazes de produzir O2–são altamente susceptíveis às infecções2. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar estes aspectos funcionais dos monócitos em portadores de esquistossomose mansônica hepatoesplênica, submetidos à esplenectomia, ligadura da veia gástrica esquerda, com ou sem, auto-implante de tecido esplênico.
MATERIAL E MÉTODOS
Desenho do estudo e seleção dos pacientes. Foram incluídos no estudo 39 indivíduos com idade entre 15 e 31 anos, 19 do sexo masculino e 20 do feminino. Comparam-as, em ensaio clínico aberto, algumas funções de fagócitos em 3 grupos. 1. Grupo controle (CG)-constituído por 12 voluntários sadios com exame físico normal. 2. Grupo com esplenectomia e auto-implante (AG)-constituído por 18 adolescentes com esquistossomose hepatoesplênica, submetidos à esplenectomia, ligadura da veia gástrica esquerda e auto-implante de tecido esplênico no grande omento. O implante teve peso total de 100g/baço. Realizou-se cintigrafia com enxofre coloidal marcado com Tecnécio 99m, no pós-operatório para confirmação de tecido implantado funcionante. 3. Grupo com esplenectomia sem auto-implante (WAG)-constituído por 9 adultos jovens com esquistossomose hepatoesplênica, submetidos à desconexão ázigo-portal, no Serviço de Cirurgia Abdominal do Hospital das Clínicas da UFPE. A infecção pelo Schistosoma mansoni foi confirmada após 3 exames parasitológicos de fezes (técnica de Hofmann, Pons e Janer) colhidos em dias alternados. Todos foram submetidos previamente à dose única de oxaminiquine (20mg/Kg de peso, via oral) e depois de 30 dias ao tratamento cirúrgico.
Obtenção de Monócitos do Sangue Periférico (PBMC). Foram coletados 18mL de sangue com EDTA de todos os indivíduos, o sangue foi diluído 1:2 em meio de cultura RPMI 1640 e separado por gradiente de densidade em Ficoll. Em seguida, as células foram ressuspendidas em 2mL de RPMI 1640 com soro fetal bovino a 3%, adicionado de antibióticos (penicilina 100U/mL e estreptomicina 100mg/mL). Após análise da viabilidade das células com azul tripan e contagem, foram incubadas em placas de 6 poços tipo Falcon (Becton&Dickinson), dispensando-se 2mL da suspensão com 106 células/ml por poço. A placa foi incubada por 1h, em atmosfera úmida, 37ºC, 5% CO2 e em seguida, as células não aderentes foram contadas em um dos poços da placa.
Avaliação do índice de aderência nos monócitos. Alíquotas da suspensão de células não aderentes, após a primeira hora de cultura, foram adicionadas ao azul tripan e contadas em hemocitômetro. O IA foi calculado através da fórmula8. IA = 100 – (n.º de células não aderidas/ml ¸ n.º inicial de macrófagos) x 100.
Dosagem do TNF-a. Foi realizada pelo método ELISA com o kit (Quantikineâ M, R&D Systems). Amostras de 100ml foram coletadas a partir do sobrenadante de cultura de monócitos estimulados por 6 horas com acetato miristato de forbol (PMA, Sigma).
Análise da liberação de superóxido (O2–). O2– foi induzido pela adição de PMA, em Hanks (HBSS, Gibco), na concentração de 2ml/mL. Foram preparados 2 sistemas de análise descontínua com avaliação a cada 1 hora, por 2 horas. A especificidade do ensaio foi garantida pela adição de superóxido dismutase (SOD) de eritrócitos bovinos (SIGMA – contendo 3000u/mg de proteína em solução final de 3mg/mL). Para o preparo destes sistemas foram utilizados monócitos em cultura (2×106 células por 2mL), tratados ou não com tuftsina, com ou sem a presença de SOD. Os sistemas foram mantidos em incubadora a 37ºC, atmosfera úmida, 5% de CO2, por 10 minutos (ativação da SOD). O ferrocitocromo c tipo IV de mitocôndria de coração de cavalo, (30mg/mL em HBSS, 2.4x 10-3 M, Sigma, USA) foi adicionado às células para quantificar a formação de O2–através da redução do ferricotocromo c. Amostras de 600ml foram retiradas de cada sistema, a 1ª alíquota recolhida, correspondia ao tempo “zero” de cada sistema e as amostras subseqüentes foram coletadas em intervalos regulares de tempo.
Determinação especfotométrica. Ao final, as amostras foram centrifugadas (25000Xg-rotor Ra-1M Kubota), 10.000 rpm, 5 min. Medidas espectrofotométricas foram realizadas a 550nm para determinar o grau de redução do ferrocitocromo c dos sobrenadantes. A curva de O2– foi obtida pela conversão dos valores de absorbância para nanomoles: [O] = 47,7 x valor da absorbância x volume da amostra coletada12.
Análise estatística. Os dados foram expressos em média ± desvio padrão. Analisou-se a diferença das médias dentro dos grupos com o teste t pareado. Entre os grupos, utilizou-se análise de variância (ANOVA) e quando esta revelou diferença significativa, utilizou-se o teste de Tukey. A significância foi definida para p< 0,05.
RESULTADOS
Índice de aderência. O índice de aderência foi expresso em porcentagem (%). Os resultados do IA de monócitos foram: do CG = 67,3 ± 14,5%, do AG = 69,2 ± 9,7% e do WAG = 66,3 ± 13,4%. Comparando-se as médias dos IA, não houve diferenças entre os grupos (ANOVA, F = 0,190; p = 0,827), Tabela 1.
Dosagem do TNF-a. Os resultados da dosagem do TNF-a foram:do CG = 135 ± 51,6 pg/mL, do AG = 97 ± 25,4 pg/mL e do WAG = 107 ±. 52,1 pg/mL. Não houve diferença entre os grupos (ANOVA, F = 0,210; p = 0,813), Tabela 2.
Liberação de O2– nos monócitos. No CG, houve aumento na produção média de O2– em monócitos estimulados entre a 1ª e a 2ª h: com PMA (14,5 ± 4,5 vs 20,8 ± 6,2; p £ 0,001 teste t pareado); com PMA + tuftsina (13,5 ± 5,1 vs 23,2 ± 8,6; p = 0,003, teste t pareado). No WAG, houve diferença na produção média de O2– entre a 1ª e a 2ª h (4,2 ± 2,2 vs 7,1 ± 2,3; p = 0,009, teste t pareado); porém, nos monócitos estimulados com PMA + tuftsina não houve aumento entre a 1ª e a 2ªh (3,7 ± 2,9 vs 6,7 ± 3,5; p = 0,052, teste t pareado). A produção média de O2– dos monócitos de AG, estimulados com PMA, não aumentou entre a 1ª e 2ª h (14,9 ± 7,3 vs 16,1 ± 5,6, p = 0,595) Figura 1. Contudo, houve aumento, entre a 1ª e 2ª h, quando estimulados com PMA + tuftsina (13,1 ± 5,6 vs 18,3 ± 8,5, p = 0,011, teste “t” pareado); Figura 2.
DISCUSSÃO
O baço é ponto importante de encontro entre a informação antigênica do sangue e o sistema imune, devido sua grande irrigação e posição central na corrente sangüínea28. Nas disfunções esplênicas, os micróbios circulam maior tempo no sangue, multiplicando-se em poucas horas9. No período precoce pós-esplenectomia, defeitos da função antimicrobiana de fagócitos contribuem para bacteremia e mortalidade subseqüentes20.
No presente estudo, o auto-implante esplênico foi realizado no grande epíploo. Este procedimento reduz a sepse pós-esplenectomia em crianças5 17. Contudo, a aderência e a produção de TNF-anão alteraram nos esquistossomóticos, pós-esplenectomia, com ou sem auto-implante esplênico. Segundo Patel24, o grande epíploo é o local mais apropriado, em função da rica vascularização, permitindo o fluxo abundante de células inflamatórias, fatores de crescimento e citocinas. O baço contém grandes quantidades de linhagens mono-macrofágicas, envolvidas na endocitose e degradação de moléculas estranhas30. Estas células participam da resposta imune pela aderência a substratos; quimiotaxia; ingestão de células e partículas inertes; fagocitose de bactérias; liberação de mediadores bioativos, de citocinas pró-inflamatórias e de radicais livres derivados do oxigênio8 29.
A aderência é o passo inicial no processo fagocítico26. Garraud et al10, usando modelo experimental de malária, concluíram que a esplenectomia, indicada na infecção malárica, não modifica a aderência monocítica. Aker et al1 concluíram não haver prejuízo da aderência celular em esplenectomizados com doença de Gaucher, na ausência esplênica pós-trauma1. Contudo, em pacientes com talassemia maior, pós-esplenectomia, há aumento da aderência neutrofílica após 20 dias, voltando ao normal 90 dias após16. Já a aderência de macrófagos murinos, pós-esplenectomia reduz e se recupera após o auto-implante4.
Os fagócitos geram reativos microbicidas como o O2–. A sua liberação depende da densidade e do tipo de células, do estímulo e de outras condições18. Picos de O2– foram encontrados com 72h e mensuráveis até 5 dias pós-estimulação15. O pico de produção de O2– por macrófagos estimulados com Enterococos faecalis, situa-se aos 60 min27. Em nosso estudo, a geração de O2– pelos monócitos dos controles, foi crescente da 1ª para a 2ª hora, tanto nos monócitos estimulados com PMA como nos tratados com tuftsina. Este aumento confirma nossos resultados prévios sobre a curva de produção do O2– em ratos, estimulados com PMA, mostrando elevação crescente até as 6h iniciais, com redução a 50% do valor máximo após 24h, em seguida valores quase imensuráveis7. No presente estudo, observamos também que os esplenectomizados têm níveis bastante reduzidos de O2–, comparados aos controles ou auto-implantados, embora apresentem o padrão de aumento na liberação da 1ª para a 2ª h. Os monócitos dos auto-implantados liberaram tanto O2– quanto os controles e ambos mais que os com esplenectomia total sem auto-implante. Nos esplenectomizados, a tuftsina não alterou a liberação de O2– em monócitos. A esplenectomia poderia reduzir a tuftsina; porém, sua concentração estava normal nos pacientes que desenvolveram esplenose após lesões traumáticas do baço31. Concordando com os nossos dados, em outro estudo, esplenectomizados revelaram migração aleatória e aderência normal dos neutrófilos, porém produção de O2– e de peróxido de hidrogênio prejudicadas16. A inoculação de polissacarídios da cápsula de pneumococos resulta em aumento na liberação de O2– pelas células de Kupffer e dano das células endoteliais nos sinusóides19. Estas alterações são atenuadas pelo tratamento com SOD ou pela esplenectomia, assim, esta reduz a produção de O2–, uma proteção contra a injúria hepática21. A função fagocítica de macrófagos diminui após esplenectomia parcial em ratos. Entretanto, o remanescente esplênico permanece com a capacidade de ser estimulado quando exposto a antígeno22. No presente estudo, não se observou aumento da 1ª para a 2ª h da produção de O2– nos monócitos dos pacientes auto-implantados pós-estímulo com PMA. Todavia, o acréscimo de tuftsina sintética à cultura dos monócitos resultou em aumento da produção de O2–. A tuftsina estimula a atividade de fagócitos. Nos demonstramos que os níveis séricos de tuftsina de crianças com esplenose são semelhantes aos das saudáveis5.
A esplenectomia parece remover uma fonte importante de macrófagos/monócitos do local de processamento de reações imunes. A produção reduzida de O2– em esplenectomizados pode ser um dos fatores implicados na resposta deficiente do hospedeiro às infecções. O auto-implante esplênico pode contribuir de forma sinérgica ou isolada para a manutenção da atividade microbicida normal dos monócitos, recuperando e mantendo as reações imunes nos fragmentos auto-implantados. Esta função dos monócitos representaria um marcador do processo patológico durante a sepse pós-esplenectomia.
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Endereço para correspondência
Dra. Celia Maria Machado Barbosa de Castro
Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA)/UFPE
Campus Universitário, 50670-420 Recife, PE
Tel.: 81 3271-8486, Fax: 81 3271-8485
e-mail: ccastro@lika.ufpe.br
Recebido para publicação em 22/8/2003
Aceito em 1/11/2004
Financiamento: Conselho Nacional de Pesquisa — CNPq
