Elaine Machado MartinezI; Renata Heisler NevesII; Regina Maria Figueiredo de OliveiraII; José Roberto Machado-SilvaII; Luís ReyIII
IDepartamento de Biologia Parasitária do Instituto Oswaldo Cruz da Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ IICurso de Biologia Parasitária do Departamento de Patologia e Laboratórios da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ IIIDepartamento de Medicina Tropical da Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ
RESUMO
A fim de verificar diferenças biológicas e morfológicas entre cepas brasileiras (CMO, CM e BE) de Schistosoma mansoni foram estudados os seguintes parâmetros: período pré-patente, cinética de eliminação de ovos nas fezes, contagem de ovos no intestino, infectividade e as características fenotípicas dos vermes adultos. O período pré-patente foi de 42 a 44 dias. A recuperação de vermes adultos variou de 26% a 29%, sem diferenças significativas (p>0,05) nestes parâmetros. Todas as cepas apresentaram maior quantidade de ovos no intestino delgado do que no grosso (p<0,05). Diferenças significativas foram observadas no aparelho reprodutor e ventosas dos adultos machos. Todas as medidas foram menores na cepa CMO. As fêmeas apresentaram diferenças significativas no maior diâmetro do ovo, área e perímetro do espinho do ovo e na área da ventosa oral. Concluímos que as diferenças entre cepas podem ser expressas mesmo quando estas são mantidas por várias gerações em condições de laboratório.
Palavras-chaves: Schistosoma mansoni. Cepas. Estudo parasitológico. Morfologia.
ABSTRACT
Aiming to determine parasitological and morphological differences between Brazilian strains (CMO, CM and BE) of Schistosoma mansoni the following parameters were studied: prepatent period, kinetics of egg releasing in feces, intestinal oogram, infectivity and the morphology of adult worms. No statistical difference (p>0.05) was found regarding the mean prepatent period (44 and 46 days) and infectivity (26% and 29%). All strains showed a higher concentration of trapped eggs in the small intestine than large intestine (p<0.05). All characteristics of the reproductive system and suckers of male worms presented significant differences (p<0.05). CMO strain was smaller in all measurements. Females showed significant differences (p<0.05) in the larger diameter of the eggs, in the area and perimeter of the spine egg and in the oral sucker area. We conclude that differences in strains can be expressed even when the strains have been cycled for several generations under laboratory conditions.
Key-words: Schistosoma mansoni. Strains. Parasitological study. Morphology. Mus musculus.
O parasitismo humano por Schistosoma mansoni é decorrente de uma linhagem de parasitos que evoluiu anteriormente em roedores13. Admite-se que esta espécie tenha surgido na Ásia, migrado para a África e atingido a região neotropical durante o tráfico de escravos52. Ao longo deste processo evolutivo, foram selecionadas subpopulações (cepas) devido ao desenvolvimento do helminto em diversas ordens de vertebrados e espécies de moluscos da família Planorbidae21 44.
Kloetzel26 questionou a existência de cepas no Brasil no final dos anos 50. Este questionamento foi esclarecido ao se demonstrar a existência de especificidade entre o parasito e diferentes espécies de Biomphalaria39 40.
Os experimentos realizados em Mus musculus demonstraram que as cepas apresentavam diferenças no período pré-patente, infectividade, patogenicidade, cinética de eliminação de ovos nas fezes e contagem de ovos no fígado ou parede intestinal15 16 24 53 55. Diferenças também foram verificadas nos vermes adultos29 30 33 37 41 47.
Diversos autores demonstraram que passagens sucessivas do S. mansoni em laboratório produzem diminuição da sua variabilidade genética, mudanças na infectividade para hospedeiros intermediários e para os definitivos20 28 47.
O presente artigo relata um estudo feito, concomitantemente, sobre as características biológicas e morfológicas de vermes adultos de cepas brasileiras de S. mansoni mantidas há mais de cinco anos em condições de laboratório, a fim de verificar se esta manutenção prolongada afetava tais características.
MATERIAL E MÉTODOS
Parasitos. As cepas aqui estudadas foram originalmente isoladas em distintos estados: BE, a partir de Biomphalaria glabrata coletada naturalmente infectada no Bairro do Telégrafo no Município de Belém do Pará (Estado do Pará); CMO, isolada a partir das fezes do roedor silvestre Oryzomys subflavus (Rodentia: Cricetidae) com infecção esquistossomótica natural no Município de Ceará-Mírim (Estado do Rio Grande do Norte) e CM obtida a partir de fezes humanas, no Engenho Pitangueiras no Município de São Lourenço da Mata (Estado de Pernambuco). Todas as cepas estão sendo mantidas por passagens sucessivas em Mus musculus Swiss Webster e Biomphalaria glabrata simpátrica, durante cinco (cepa CM) ou vinte anos (cepas BE e CMO), no Departamento de Malacologia do Instituto Oswaldo Cruz.
Infecção experimental. Trinta e nove camundongos fêmeas, com 35 a 40 dias de idade, pesando 20 gramas, foram fornecidas pelo Centro de Criação de Animais de Laboratório (CECAL-FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brasil). Cada lote com 13 animais foi infectado por via subcutânea com 80 cercárias recém eliminadas por B. glabrata, infectada por uma das cepas acima mencionadas. Após a infecção, os animais foram mantidos em gaiolas de polipropileno (40cm x 33cm) e alimentados com a ração industrializada convencional Nuvilab CR1 (município de Colombo, Estado do Paraná, Brasil) e água ad libitum. Os experimentos foram realizados de acordo com os procedimentos éticos com animais de experimentação56.
Estudo biológico. Eliminação de ovos nas fezes: entre 35 e 54 dias após a infecção, amostras de fezes de 24 horas foram recolhidas, individualmente, três vezes por semana. A análise parasitológica foi realizada pelo método de Kato-Katz25 e uma técnica por sedimentação quantitativa47. Em cada exame foram analisadas duas lâminas por animal. A viabilidade dos ovos foi aferida segundo movimentos do miracídio no interior do ovo ou atividade das células em flama.
Determinação da infectividade: após nove semanas de infecção, todos os animais foram sacrificados por deslocamento cervical, perfundidos com salina citratada a 0,9% e necropsiados50.
Distribuição quantitativa dos ovos nos segmentos intestinais: de cada animal, os intestinos delgado e grosso foram separados. O intestino delgado foi dividido em duas metades uma proximal e outra distal. Da porção anterior de cada segmento foi retirado 1cm de comprimento.
Do segmento grosso, uma amostra foi retirada da porção justa-anal31. Os fragmentos foram digeridos em 5ml de hidróxido de potássio a 4% em banho-maria a 56oC por 120 minutos10. Após a digestão, o material foi centrifugado a 2000rpm por três minutos. Ao sedimento foram acrescentados 0,5ml de água destilada e retiradas 5 alíquotas de 100ml para leitura em microscópio de luz, com aumento de 100 vezes. Como o tamanho dos segmentos foi determinado durante a necropsia, o número total de ovos foi estimado em cada segmento por regra aritmética, considerando-se o tamanho do segmento e o número de ovos contados na alíquota.
Estudo morfológico dos vermes adultos. Os vermes adultos foram fixados em AFA (álcool, formalina e ácido acético glacial), corados por carmim clorídrico, clarificados com salicilato de metila e montados em lâmina histológica com bálsamo do Canadá37.
O estudo morfométrico dos vermes adultos foi feito em um sistema computadorizado de análise de imagens (Image Pro Plus – Media Cybernetics) com análise dos seguintes caracteres dos lobos testiculares: número, área, maior e menor diâmetro e perímetro. No ovo uterino e o espinho foram estudados a área, maior e menor diâmetro e perímetro. Em ambos os sexos foram medidas as áreas das ventosas oral e ventral e a distância entre elas37. Foram analisados 150 espécimes machos: 60 (BE), 51(CM) e 39 (CMO); e 127 fêmeas: 49 (BE), 32 (CM) e 46 (CMO).
Análise estatística. Para os dados biológicos foram aplicados os testes de Mann-Whitney e de Regressão de Correlação linear49; e para os morfológicos, a Análise de Variância (One Way Anova). Valores de p<0,05 foram considerados significativos.
RESULTADOS
Entre os parâmetros analisados, foram verificadas diferenças significativas (p=0,0001) apenas no percentual de distribuição de ovos do segmento grosso: 2% (cepa CMO), 4% (cepa CM) e 7% (cepa BE). Todas as cepas apresentaram maior concentração de ovos (cerca de 80%) no segmento distal (Figura 1). Através dos Testes de Regressão e Correlação Linear foi demonstrada uma correlação positiva (p=0,001 e r=0,848) entre a contagem de ovos no intestino e o número total de fêmeas adultas e o total de ovos nas fezes (p=0,007 e r=0,731), apenas na cepa CMO.
Em todas as cepas, o período pré-patente foi de 42 (cepa CM) a 44 dias (cepas BE e CMO). A partir do 47º dia de infecção houve um aumento progressivo na eliminação de ovos nas fezes até o último exame (54º dia). Na cepa BE foi pequeno o aumento (Figura 2). O número total de ovos eliminados nas fezes variou entre 1.872 (cepa CMO) e 6.408 (cepa CM). Embora a cepa CM tenha maior contagem de ovos, a viabilidade dos ovos foi menor (2%) do que na CMO (38%) e na BE (68%).
Quanto a infectividade (percentual de recuperação de vermes adultos), não foram evidenciadas diferenças significativas (p=0,943) entre as cepas: CM (23,6±6,3%), CMO e BE (20,8±6,0%). A proporção entre macho/fêmea foi de 1:1 (cepas BE e CM) e 0,9:1 (cepa CMO).
Os valores morfométricos dos espécimes machos estão discriminados na Tabela 1. Entre os cinco caracteres lobos testiculares analisados, todas as cepas apresentaram diferenças significativas (p<0,05) na área, nos diâmetros e no perímetro. Também foram encontradas diferenças significativas na área da ventosa ventral. Todos os oito caracteres da cepa CMO eram menores do que nas demais cepas. A comparação entre os dados biométricos da cepa CMO com a cepa CM apontou diferenças significativas (p<0,05). Apenas o número dos lobos testiculares e a distância entre as ventosas, não foram significativamente diferentes (p>0,05) entre as cepas BE e CMO.
O diâmetro menor dos lobos testiculares, a área da ventosa oral e a distância entre as ventosas foram significativamente diferentes (p<0,05) entre as cepas BE e CM. Apenas na cepa BE foram encontrados espécimes (4) com lobos testiculares supranumerários.
A análise morfométrica das fêmeas demonstrou diferenças significativas (p<0,05) entre as cepas, porém em menor número de caracteres (Tabela 2). Nenhum dos caracteres estudados apresentou diferença significativa entre as três cepas. Diferenças significativas (p<0,05) foram observadas na área e no perímetro do espinho (cepa BE x CMO) e no maior diâmetro do ovo (cepa BE x CM). Entre as cepas CM e CMO, as diferenças ficaram limitadas à área da ventosa oral.
DISCUSSÃO
O camundongo é o hospedeiro mais utilizado no estudo das características parasitológicas e morfológicas de cepas de S. mansoni, sobretudo porque é de fácil manutenção em laboratório, elimina ovos férteis nas fezes e os vermes adultos apresentam pleno desenvolvimento somático29 33 38.
Bain & Philipp4 citam que um parasito utilizado em condições de laboratório descende de uma ou mais populações naturais com polimorfismo genético que, nessa nova condição, reduz a sua variabilidade. Como as cepas reduzem o polimorfismo genético, seria de se esperar que não ocorressem mudanças biológicas e morfológicas, ou ambas, nos vermes adultos.
Em hospedeiros permissivos, tais como o homem e camundongos, o início da oviposição ocorre em torno de 4-5 semanas após o contato com as cercárias. Através do oograma de tecidos intestinais demonstrou-se que, tanto em humanos46 quanto em camundongos43, os ovos produzidos pelas fêmeas passam por quatro estágios de maturação, até que sejam expelidos embrionados pelas fezes. Assim como os helmintos intestinais23, os vermes adultos de S. mansoni também apresentam um nicho de oviposição. Há evidências de que os sais biliares transportados pela veia porta estimulem a oviposição in vitro do S. mansoni3. Em nosso experimento, todas as cepas apresentaram maior deposição de ovos no segmento distal do intestino delgado do que no intestino grosso15 31. Esta situação contrasta com estudos em primatas (inclusive o homem), onde tem se verificado que o sítio de oviposição é no intestino grosso. Por outro lado, a partir de um vasto estudo sobre a infecção esquistossomótica em casos autopsiados no Estado da Bahia (Brasil), concluiu-se que a forma clínica da doença afeta a distribuição topográfica dos ovos e dos vermes adultos de S. mansoni. Assim, a proporção de vermes e a concentração de ovos no colo transverso e porção média do jejuno foram maiores nos indivíduos com fibrose de Symmers do que nos indivíduos com formas menos graves11.
Outro aspecto a ser destacado é que as cepas apresentaram diferenças na capacidade de migração no sistema porta como já descrito54. Entretanto, não se conhece o que determina esta diferença. A mudança do estado de hermafroditismo para sexos separados implicou no surgimento do canal ginecóforo, desenvolvimento acentuado de musculatura dos vermes machos e do sistema genital feminino, e redução da capacidade locomotora das fêmeas35 45. O papel dos adultos machos é, principalmente, transportar as fêmeas para o sítio de postura de ovos, que é facilitado por sua musculatura 34 35. Curiosamente, a cepa CMO apresentou a menor capacidade de deslocamento e o menor número de ovos nas fezes. Em publicação anterior verificamos que o comprimento dos adultos machos era significativamente menor do que em outras cepas29. Por outro lado, nesta cepa observamos um maior percentual de ovos viáveis. Um estudo desenvolvido a partir de um único casal de vermes poderia esclarecer se a redução de tamanho dos vermes adultos machos afeta a sua capacidade de migração e a oviposição das fêmeas.
A contagem de ovos nas fezes de camundongos tem sido utilizada para determinação do período pré-patente da infecção esquistossomótica experimental e, mais raramente, para avaliar a cinética de eliminação de ovos na fase inicial da infecção46. Neste experimento, não foi confirmado que cepas apresentam diferenças no período pré-patente1 14 18. Segundo alguns autores18, as cepas que são mantidas por mais tempo em laboratório apresentam o menor período pré-patente. No nosso caso, contudo, o menor período pré-patente foi da cepa mais recente mantida em laboratório (CM).
A dinâmica de eliminação de ovos nas fezes não tem sido avaliada nos estudos comparativos entre cepas brasileiras de S. mansoni. De acordo com os nossos resultados, as cepas apresentaram o mesmo comportamento. O padrão de eliminação foi semelhante ao descrito para a fase inicial de infecção: início com baixa contagem e um aumento progressivo (entre 49 e 72 dias pós-infecção)46. Estudos in vitro evidenciaram que a oviposição é caracterizada por três etapas: uma fase inicial onde as fêmeas produzem poucos ovos, um período de máxima oviposição e, finalmente, uma redução progressiva no número de ovos eliminados5 17. Isto ocorre cerca de três semanas após o período pré-patente5 17 46. Neste experimento, a diminuição de oviposição não foi observada porque os exames parasitológicos foram realizados entre a sexta e a oitava semana de infecção.
A contagem de ovos é um indicador de fecundidade de vermes adultos mantidos in vivo e in vitro. Nestes ensaios foi demonstrado que há relação entre o número de ovos produzidos e a carga parasitária2 5 12 17. No modelo murino, esta relação foi também observada na fase inicial da infecção esquistossomótica46. No presente experimento verificamos correlação positiva entre a produtividade de ovos (fezes e contagem de ovos no intestino) e o número de vermes adultos, apenas em uma das cepas (CMO). Entretanto, não é conhecido se este fator é variável entre cepas.
A taxa de maturação de cercárias em vermes adultos (infectividade) é também um critério aplicado na diferenciação de cepas. Não foi possível distinguir as cepas por este critério, embora os valores obtidos estejam de acordo com aqueles citados (entre 21 e 61%) para outras cepas brasileiras1 55. Outros autores verificaram que uma cepa humana era mais infectante para camundongo do que uma outra de roedor, ambas do Vale do Rio Paraíba do Sul (São Paulo)6.
Os dados sobre a recuperação de vermes adultos demonstram que entre as cepas estudadas, a proporção foi semelhante entre machos e fêmeas (exceto na cepa CMO). A origem desta desproporção tem sido exaustivamente estudada desde a década de 40 e não está esclarecida27 42 51. Ao que parece, cada sexo apresenta distinta estratégia de transmissão: cercárias machos apresentam maior infectividade9 57 enquanto as fêmeas exibem maior longevidade9, em condições experimentais. Por outro lado, pode não haver predominância de um sexo (macho) e, mesmo assim, a infectividade ser máxima. Admite-se que nesta situação de equilíbrio haja uma interação entre os sexos, onde a presença do macho estimularia a infectividade das fêmeas7. Nossos dados fortalecem esta hipótese, embora sem diferença significativa, a maior infectividade foi observada em cepas cuja proporção entre macho e fêmea era de 1:1. Em hospedeiros permissivos, distintos genótipos do parasito poderiam se desenvolver, induzindo a uma acentuada competição entre as fêmeas e como conseqüência o aumento no número de machos8.
Neste experimento, as alterações morfológicas nos vermes adultos foram mais significativas do que os dados biológicos. Geralmente, o número de testículos e a distância entre as ventosas (em machos e fêmeas), o comprimento dos vermes adultos e o tamanho do ovo são utilizados como caracteres taxonômicos na descrição morfológica de cepas. O primeiro parâmetro varia segundo a cepa, independentemente de ser alopátrica33 47 ou simpátrica29 30. Recentemente, propusemos outros caracteres que foram empregados em cepas simpátricas. Diferenças significativas (p<0,05) foram detectadas nos vermes de ambos os sexos: em todas as medidas dos ovos, espinhos e ventosas (fêmeas) e nos machos, o perímetro, eixos e diâmetro dos lobos testiculares37.
No presente trabalho foram utilizadas três cepas alopátricas mantidas durante várias gerações em laboratório e, mesmo assim, alguns caracteres eram diferentes entre todas as cepas ou entre duas delas. Assim, confirmamos que os vermes adultos machos de cepas mantidas por várias gerações em laboratório também apresentam diferenças morfológicas entre si29 30. Em recente publicação verificamos que os vermes adultos machos da cepa CMO apresentavam menor número de lobos testiculares e menor distância entre as ventosas do que outras cepas brasileiras (BH-Belo Horizonte, Minas Gerais e SJ-São José dos Campos, São Paulo)30. Os vermes adultos das cepas BE e CM foram pela primeira vez estudados no presente experimento.
O estudo dos lobos testiculares confirmou que alguns espécimes apresentavam lobos em posição anormal ou supranumerários29 30 36 37. O significado morfo-fisiológico desta estrutura é desconhecido: órgão reprodutivo funcional ou degenerado? De acordo com nossos estudos por microscopia de varredura laser confocal, os lóbulos supranumerários não apresentam as mesmas células ou espermatozóides dos lóbulos testiculares normais e nem a estes estão conectados32.
Poucos autores utilizaram os vermes adultos fêmeas nos estudos comparativos entre cepas19 33 41. Os caracteres por outros autores analisados foram o comprimento do espécime, distância entre as ventosas e tamanho do ovo. A análise destes dois últimos caracteres permitiu-lhes a distinção entre duas cepas (BH e SJ). Esta observação difere de nossos experimentos anteriores onde todos os caracteres do sistema reprodutor e das ventosas foram significativamente diferentes37.
As cepas estudadas neste experimento foram provenientes da mesma instituição com passagens seriadas e exclusivas em B. glabrata simpátrica e no camundongo albino. Portanto, todas sofreram a mesma pressão seletiva. Modificações induzidas pelo hospedeiro murino aparecem nas primeiras gerações das cepas em condições de laboratório22 ou já na primeira passagem27. Conclui-se que as diferenças naturais (biológicas e morfológicas nos vermes adultos) das cepas são expressas, mesmo com a sua manutenção prolongada em condições de laboratório.
AGRADECIMENTOS
Ao excelente apoio técnico de Maria de Fátima Bastos Martins, Disciplina de Parasitologia, Universidade do Estado do Rio de Janeiro e a Dra. Lygia dos Reis Corrêa, Departamento de Malacologia, Instituto Oswaldo Cruz, pelo fornecimento das cepas.
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Endereço para correspondência
Dr. José Roberto Machado e Silva
Curso de Biologia Parasitária/Depto de Patologia e Laboratórios/FCM/UERJ
R. Prof. Manoel de Abreu 48/5º andar, Vila Isabel
20551-170 Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Telefax: 55 21 2587-6148
E-mail: machado@uerj.br
Recebido para publicação em 15/4/2002
Aceito em 23/7/2003
