Elúzio José Lima CerqueiraI, II; Italo SherlockI; Alberto GusmãoII; Aryon de Almeida Barbosa JuniorI; Maria NakataniIII
ILaboratórios de Parasitologia e Entomologia e Laboratório de Histopatologia do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz da Fundação Oswaldo Cruz, Salvador, BA IIFaculdade de Farmácia e Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia, Salvador, BA IIILaboratório de Diagnóstico de Doenças Infecciosas do HUPES/UFBA, Salvador, BA
RESUMO
Quatro Equus asinus foram inoculados com promastigotas de Leishmania chagasi Cunha & Chagas, 1937 e acompanhados durante 12 meses através de: pesquisa de amastigotas em esfregaços e culturas de sangue periférico em fragmentos de tecido do lábio inferior, medula óssea, baço e fígado e de testes de ELISA e TRALd. Estes foram positivos nos 8º, 10º e 12º meses após a inoculação. O exame histopatológico pós necropsia, demonstrou discreto número de amastigotas no fígado de dois dos eqüídeos inoculados. Apesar de desafiados com elevado número de promastigotas, os animais não desenvolveram infecções patentes e não infectaram experimentalmente a vetora Lutzomya longipalpis. Os resultados induzem a acreditar que os eqüídeos são desprovidos de importância como reservatórios na cadeia de transmissão da leishmaniose visceral, embora sirvam como boa fonte de alimentação sangüínea e proliferação da vetora Lutzomyia longipalpis.
Palavras-chaves: Leishmania chagasi. Infecção experimental. Eqüídeos. Equus asinus. Lutzomyia longipalpis.
ABSTRACT
Four Equus asinus were challenged with promastigotes of Leishmania chagasi Cunha & Chagas, 1937, and followed up for 12 months. They were observed by means of direct testing for promastigotes in smears and culture of peripheral blood, fragments from inferior lip, bone marrow, spleen and liver and the immunological assays ELISA and TRALd. The post-necropsy histological examination demonstrated a small number of amastigotes in the liver of two animals. ELISA and TRALd tests were positive at the 8th, 10th and 12th month after inoculation. The results suggest that the donkeys were able to overcome the experimental leishmanial infection and did not infect the vector Lutzomyia longipalpis in the laboratory. Consequently they can not be considered an important reservoir in the epidemiological chain of transmission of visceral leishmaniasis, although they represent an important blood source for the vector and its proliferation.
Key-words: Leishmania chagasi. Experimental infection. Equidae. Equus asinus.
Observações sobre eqüídeos com leishmaniose têm sido feitas desde 192736 mas, só recentemente, esses animais foram melhor investigados como hospedeiros de leishmanias. Na Venezuela3 4 5 6 12 22, foi encontrada Leishmania braziliensis2 em lesões cutâneas de Equus caballus e Equus asinus. No Brasil9 10 16 26 27,foram registradas lesões leishmanióticas, também causadas pela Leishmania braziliensis,em Equus asinus e Equus caballus. A investigação através da intradermorreação, realizada em 54 animais, revelou 44,4% de positividade desse teste cutâneo25. Na análise de 250 amostras de soros de eqüinos, 11,6% apresentaram reatividade para o ELISA. Os autores sugerem que os eqüinos poderiam estar atuando nessas áreas como reservatórios de leishmaniose cutânea, contribuindo para a manutenção da doença no peridomicílio. Na Bahia,um inquérito, através ELISA em eqüídeos foi positivo para 17 (22%) dos animais examinados, embora nenhum apresentasse lesão sugestiva de leishmaniose17.
Esses achados relativos a Leishmania braziliensis, acrescidos do fato de que eqüídeos estão sempre presentes nas áreas endêmicas de leishmaniose visceral na Bahia, estimulou-nos a investigar sobre a possibilidade desses animais serem também hospedeiros e reservatórios de Leishmania chagasi. Os resultados dessas observações serão apresentados em uma série de trabalhos que pretendemos publicar, sendo este o primeiro a respeito.
MATERIAL E MÉTODOS
Exame clínico, inoculação e cepa de Leishmania. Quatro fêmeas sadias de Equus asinustrazidas do Município de Jacobina para Salvador, com 3 e 4 meses de idade, pesando cerca 40kg cada, foram mantidas em baia telada, na Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia, isoladas de outros animais, sob os cuidados de um tratador. Previamente, esses animais foram submetidos a um exame clínico geral e deles colhido sangue para verificação da negatividade sorológica para Leishmania. Os animais foram em seguida desafiados, por via intravenosa, com um inóculo de promastigotas de Leishmania chagasi (cepa IOCLc2455) em fase estacionária, multiplicadas em meio de cultura LIT. Foram inoculadas 108 promastigotas em 1ml de cultura, por kg de peso do eqüídeo.
Como controle da infectividade da Leishmania, a mesma cepa foi inoculada em hamsters, por via interperitonial, porém em dosagem menor. Estes animais controles foram necropsiados após 6 meses, tendo-se confirmado a patogenicidade do parasito para o hamster.
Depois do exame clínico inicial, os animais foram submetidos à coleta de 15ml de sangue para ELISA e TRALd; pesquisa de amastigotas em esfregaços corados, para hemoculturas e reações imunossorológicas.
Em 5ml de sangue colhido da jugular, adicionou-se anticoagulante; após centrifugação, fez-se a separação da camada branca dos leucócitos, que foi semeada em meio de cultura NNN+LIT. Os animais observados foram ainda submetidos à biópsia do lábio superior; sendo parte deste material semeado em meio de cultura e dele também feitos alguns esfregaços em lâminas. De cada fragmento da biópsia, parte era colocada em soro fisiológico com antibiótico e, posteriormente, semeada em meio de cultura; outra parte era preservada em formol a 10% para estudo histopatológico.
Após a inoculação, esses animais ficaram em observação diária e foram submetidos, de dois em dois meses, à biópsias e a novas coletas de sangue para a realização, como controle, dos mesmos exames acima mencionados, tendo os procedimentos a seguir descritos.
Anestesia e biópsias.Previamente às intervenções invasivas, os animais foram sedados com 2ml de dormosedan (detomidine hydrochloride), analgésico e sedativo para uso exclusivo em eqüídeos.Fez-se a tricotomia e a assepsia com álcool iodado no local, onde foi feita a biópsia do fígado, baço e medula óssea, por meio de seringa de 10ml e agulha de 30x8mm; de cada órgão eram feitos 5 esfregaços.
Para a biópsia do lábio, utilizou-se punch de 5mm de diâmetro; do fragmento biopsiado, com parte fez-se cultura e 5 esfregaços em lâminas; outra parte foi colocada em salina com antibiótico (1 ampola de garamicina para 500ml da solução), mantendo-a entre 4 a 8ºC por 12 horas. O fragmento foi depois transferido para outro tubo contendo meio de cultura e ainda uma terceira parte era colocada em formol a 10%, para estudo histopatológico.
Ainda, foram realizados, com parte dos fragmentos, esfregaços em lâminas, semeio em meio de cultura e inoculação em hamsters.
Pesquisa de amastigotas em esfregaços em lâminas.Para cada animal inoculado, foram confeccionadas cinco lâminas com esfregaço de sangue e dez lâminas com material de biópsia do lábio inferior. Os esfregaços foram corados pelo Panótico Rápido LB® (LABORCLIN)7 13 para a pesquisa de amastigotas em microscopia óptica. Após a necropsia, procedeu-se da mesma forma para a confecção dos esfregaços dos diversos órgãos.
Cultura para isolamento do parasito. O sangue coletado em tubos com EDTA foi centrifugado, durante 30 minutos a 3.000rpm, separado o soro, acrescentados 5ml de solução fisiológica e novamente centrifugado, durante 15 minutos a 3000rpm, sendo a camada branca de leucócitos transferida para o meio de cultura.
As biópsias do baço, fígado e medula óssea foram conservadas na própria seringa e colocadas em uma caixa de isopor contendo gelo e, transportadas da Escola de Medicina Veterinária ao Laboratório de Parasitologia e Entomologia (LAPEN) do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz (CPqGM), onde foram semeadas.
As culturas foram observadas a fresco, semanalmente, durante 5 semanas, através de uma gota do material entre lâmina e lamínula, em microscópio óptico. O meio de cultura empregado foi à associação Liver Infusion Triptase (LIT) e Novy-McNeal- Nicolle (NNN).
Exame histopatológico. Fragmentos obtidos após a necropsia do: fígado, baço, medula óssea, pulmão, coração, intestino, músculo liso, músculo estriado e pele da orelha foram fixados em formol a 10% e submetidas a processamento histológico rotineiro. Cortes de 5 micrômetros, de cada órgão, foram corados pela hematoxilina e eosina e examinados por microscopia de luz.
Teste ELISA. Os soros obtidos por centrifugação, foram mantidos a -20ºC até o momento da realização do teste ELISA. A pesquisa de IgG pelo ELISA foi realizada segundo as técnicas descritas8. Foram realizados dois tipos de ELISA. No primeiro (ELISA I), foi utilizado como antígeno um lisado crude de Leishmania (Leishmania chagasi lysate) e, no segundo (ELISA II), a proteína rk39, ambos expostos a um conjugado anti-horse. Os dois antígenos foram fornecidos pela CORIXA CORP de Seattle, WA, USA. A diluição do soro foi de 1:100, em solução tampão PBS 0.01M e pH 7,2. O conjugado usado foi o anti-horse IgG da SIGMA, A-6917, diluído em 1:10.000, em solução tampão PBS 0,01M + 1% Tween 20 + 0,1% BSA. O substrato usado foi o TMB Microwell Peroxidase Substrate – Kirkegaard & Perry Laboratories. As placas de ELISA foram sensibilizadas com as seguintes concentrações: crude = 1ug/well e rk39 = 25ng/well, diluídos em tampão carbonato 0,01M pH 9,6 com incubação de 15 minutos para cada etapa. A solução STOP foi o ácido sulfúrico 1N. A solução de lavagem foi o tampão PBS 0,01M pH 7,2 + 1% Tween 20. Leitura das placas em 450nm. O valor do cut-off foi calculado a partir da densidade ótica (DO) média de um grupo de 30 amostras de soro de cavalo, mais três desvios padrões. As amostras referidas foram fornecidas pelo Instituto Butantã de São Paulo, após a comprovação de sua negatividade para leishmaniose.
Teste TRALd. O Teste Rápido Antígeno para Leishmania donovani (TRALd) é um teste qualitativo imunocromatográfico in vitro, com alta especificidade para detecção de anticorpos para Leishmanias viscerotrópicas no soro e plasma8. O TRALd utiliza como antígeno a proteína rk39, clonada de Leishmania chagasi e proteína A mais ouro coloidal como controle (Manufactured por Health Watch Products, Inc of Stanford, CT, US)11 15 23 24. O kit tem uma janela para leitura do resultado, com uma área de controle superior (C), uma área de controle inferior (T) e um lugar (S) para colocar uma gota da amostra a ser testada. A presença de anticorpos para Leishmania é indicada pelo aparecimento de distintas linhas púrpuras na janela de leitura, ambas ao nível de (T) e (C). Na ausência de anticorpos de Leishmania, somente a linha controle, confirma que o teste foi realizado corretamente e o reagente funcionou adequadamente. Portanto, duas linhas indicam um resultado positivo, enquanto uma linha na área controle (C) indica um resultado negativo (Figura 1).
Xenodiagnóstico.Os animais foram submetidos ao xenodiagnóstico com flebótomos, antes e após o desafio com Leishmania, usando-se 30 exemplares fêmeas de L. longipalpis criadas em laboratório. Exemplares de flebótomos dessa colônia foram previamente confirmados como bastante susceptíveis a infecções com L. chagasi. Empregou-se caixinhas especiais contendo aberturas vedadas por malha de nylon fina, seguindo a técnica rotineiramente usada nos Laboratórios de Parasitologia/Entomologia do CPqGM. Os insetos foram dissecados e examinados para flagelados, oito dias após sugarem o animal em observação. Dois meses após a inoculação, foi realizado o primeiro xenodiagnóstico e, daí em diante, foram realizadas nos meses 4, 6, 8, 10 e 12, final da observação, quando os animais completaram 12 meses de inoculados.
RESULTADOS
Após os dois primeiros meses da inoculação, o animal de número 4 adoeceu gravemente sendo por isto sacrificado.
Quanto aos outros três animais, que foram necropsiados 12 meses após a inoculação, apresentavam bomestado nutricional e, embora não mostrassem alterações clínicas aparentes, os seus exames macroscópicos evidenciaram espessamento esbranquiçado disseminado no parênquima hepático, sugestivo de necrose focal; pele, mucosas e tecido subcutâneo pálidos; linfonodos pré-escapulares: aumentados de volume, pálidos e edemaciados. Esôfago: com mucosa pálida. Estômago: regiões glandular e aglandular de tonalidade pálida. Pulmões: superfícies periféricas dos lobos revelando irregularidades, caracterizadas por pequenas áreas elevadas, pálidas e hipercrepitantes (enfisema alveolar multifocal agudo); gordura pericárdica e musculatura cardíaca pálida. Baço: redução de volume total, com discreta consistência ao tato. Superfície externa de tonalidade pálida. Ao corte, discreta reatividade da polpa branca, caracterizada por pontos milimétricos salientes de coloração acinzentada, disseminados com hipertrofia de polpa branca. Fígado: redução de volume total, com superfície lisa. Cápsula e parênquima superficial, revelando lesão cicatricial focal, com aproximadamente 0,5 centímetro de comprimento. Presença marginal, em um dos lobos, de múltiplos pontos milimétricos com tonalidade variando de brancacenta a branco-amarelada, de consistência firme, que se aprofundavam no parênquima superficial (focos calcificados). Bexiga: mucosa pálida. Intestinos delgado e grosso com serosas pálidas. Presença de conteúdo semipastoso a líquido, de tonalidade vermelho-escurecida, no lúmem de todo o trato intestinal.
A pesquisa nos esfregaços foi negativa para amastigotas. As culturas de sangue e de fragmentos obtidos por biópsias também foram negativas para todo o material examinado. Já os hamsters inoculados com a mesma cepa de Leishmania dos eqüídeos e que foram observados durante seis meses, como já nos referimos, apresentaram evolução da infecção leishmaniótica, comprovando a patogenicidade do parasita. Formas amastigotas foram detectadas nos esfregaços corados de seus baços e fígados.
Além do descrito como generalidades, o eqüídeo de número 1 apresentou: fígado com esteatose periportal; baço com acentuada congestão; pele com discreto número de linfócitos e alguns plasmócitos em acúmulos focais. Os demais órgãos (pulmão, coração, músculo liso, músculo estriado esquelético) não apresentaram anormalidades. Não se observou elementos parasitários.
O animal de número 2 apresentou o fígado com arquitetura geral preservada, hiperplasia das células de Kupffer, acúmulos focais de plasmócitos, necrose hepatocelular focal e granulomas macrofágicos contendo elementos arredondados de 1-5 micrômetros, identificados como amastigotas de Leishmania (Figura 2); baço: com aumento de trabéculas fibrosas e congestão; pulmão: apresentando áreas de espessamento septal; pele da orelha: acúmulos focais de plasmócitos e poucos macrófagos. Os outros órgãos examinados (coração, músculo liso, músculo estriado esquelético) não apresentaram anormalidades.
O animal de número 3 apresentou: fígado congesto com arquitetura geral preservada; acúmulos focais de plasmócitos, necrose hepatocelular focal e granulomas macrofágicos, contendo elementos arredondados de 1-5 micrômetros, identificados como amastigotas de Leishmania; baço: congesto; polpa vermelha, polpa branca e septos fibrosos normais; pele do lábio com hiperplasia epitelial, discreto número de mononucleares subjacentes, sugestivo de queilite crônica; pele da orelha: acúmulos focais de plasmócitos e poucos macrófagos. Os demais fragmentos tissulares dos órgãos (coração, pulmão, tecido adiposo, músculo liso e músculo estriado esquelético) não apresentaram anormalidades.
Os resultados dos testes de ELISA estão relacionados na Tabela 1. Como se constata, o animal numero 1 apresentou resultados negativos em todos os 12 meses da observação.
O TRALd foi positivo para os animais numero 2 e 3 a partir do oitavo mês da inoculação, repetindo-se a positividade nos 10º e 12º meses (Figura 1).
Como já informamos, o animal número 4 foi sacrificado logo no segundo mês da inoculação, porque adoeceu gravemente com outra patologia.
Todos os xenodiagnósticos para Leishmania com o Lutzomya longipalpis foram negativos para os animais inoculados.
DISCUSSÃO
Nas zonas rurais do Brasil, os eqüídeos são usualmente utilizados como meio de transporte ou de carga, movimentando-se constantemente pelos diversos recantos das localidades endêmicas. São excelentes atrativos e fonte sanguínea para a alimentação dos flebotomíneos, estimulando dessa forma a proliferação desses vetores.
O fato de termos usado animais provenientes da área endêmica de Jacobina, não parece ter interferido na observação pois os referidos animais estavam negativos no controle preliminar e em dois dos três animais observados, foi possível demostrar a infecção através de exames hitopatológicos e testes sorológicos.
O parasitismo das vísceras por Leishmania no fígado de dois dos eqüídeos inoculados demonstrado pelo exame histopatológico, para fins de diagnóstico é relevante pois, a punção desses órgãos pode vir a ter resultado positivo na busca do parasitismo. Também, os testes ELISA e TRALd foram valiosos pois apresentaram 50% de positividade.
Em relação a escolha do tipo de inóculo, sabe-se que amastigotas são mais infectantes do que as formas promastigotas em hamsters20, em cães1 14 18 e gatos21. No presente trabalho, foram utilizadas as formas promastigotas, por serem elas de mais fácil acesso nas condições que trabalhamos. Não se levou em conta que a alta carga parasitária do inóculo de formas de baixa infectividade poderia contribuir para o aparecimento de uma resposta imune devido a antigenemia promovida pela alta dose do inóculo e baixa infectividade das formas, o que não parece ter ocorrido com o nosso experimento desde que, em dois dos três animais inoculados foi mantida a infecção por um ano, embora com discreto número de parasitas que não conseguiram infectar experimentalmente o vetor.
Relativo à via de inoculação, um trabalho sobre leishmaniose visceral canina experimental18mostrou que a via endovenosa proporcionou taxa de infecção superior à obtida por via intradérmica, independentemente da dose do inóculo. A taxa de infecção obtida nas diferentes doses de inóculo e vias de administração foram variadas nos animais inoculados com culturas de Leishmania chagasi. A dose de104 promastigotas não resultou infectante para os animais que testaram. Os inóculos com 105 e 106 promastigotas mostraram taxas de infecção semelhantes, sendo que 107 promastigotas foi a dose que conseguiu infectar maior (61,5%) número de animais. Outros autores conseguiram também infectar cães com doses de inóculo de amastigotas de L. chagasi e L. donovani que variavam de 107, 108 e 1010 parasitas/kg de peso corporal1 19, concluíram que a via endovenosa eram a mais eficaz para infectar os animais com formas amastigotas. Tomamos como base a experiência dos autores citados e optamos pela via endovenosa para a inoculação de 1×108 parasitos/kg de peso corporal.
Finalmente, com base em nossas observações, concluímos que: 1) A pesquisa de amastigotas em lâminas, cultura e isolamento do parasita e biópsias e estudo da medula óssea, do baço e do fígado, apresentaram resultados negativos nos exemplares de Equus asinus observados; 2) Contudo, o parasitismo por Leishmania foi demonstrado, após necropsia aos 12 meses de inoculação, através do exame histopatológico do fígado de dois dos eqüídeos inoculados. Estes dois animais também apresentaram os testes de ELISA e TRALd positivos no 8º, 10º e 12º meses da inoculação; 3) Parece que os animais inoculados com a elevada carga de promastigotas deLeishmania chagasi, devido a capacidade imunológica do mamífero ou a antigenemia conseqüente a elevada dose do inóculo e baixa infectividade da forma promastigota, foram capazes de amenizar a progressão da infecção, promovendo, espontaneamente, a diminuição da carga parasitária; 4) O escasso parasitismo, na circulação periférica e na pele do animal dificultou a infecção do flebótomo. Isto, provavelmente, torna o animal, sem importância na cadeia epidemiológica como reservatório do parasita; 5) Entretanto, os eqüídeos mantêm certo grau de importância na ecologia da leishmaniose visceral como fonte sanguínea para os flebótomos, possibilitando aumento da reprodução e densidade do vetor, elevando conseqüentemente o risco de transmissão do agente etiológico.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao Dr. Roberto Badaró, pelas facilidades que promoveu para a realização deste trabalho; ao Dr. Moacyr Paranhos, ao mestrando Evandro Morais Silva, pela colaboração durante a realização das observações; aos técnicos Antônio Carlos dos Santos, do Laboratório de Parasitologia e Entomologia do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz/FIOCRUZ, José Serafim, Zacarias dos Santos e Washington França da Silva, da Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia pela ajuda nos exames, manutenção e realização das necrópsias dos animais.
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Endereço para correspondência
Prof. Elúzio J. L. Cerqueira
CPqGM/FIOCRUZ
Rua Valdemar Falcão 121
Brotas, Salvador, BA
Tel: 55 71 356-8785; Fax: 55 71 356-4292
Recebido para publicação em 29/4/2002
Aceito em 29/10/2003
Trabalho realizado com financiamento do CNPq Auxílio 000521130-98 e Capes
