Marcos Fábio G. Rocha, José Júlio C. Sidrim e Aldo Ângelo M. Lima
Departamento de Medicina Veterinária da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará. Laboratório de Micologia Médica do Depto de Patologia e Medicina Legal, Unidade de Pesquisas Clínicas e Deptº de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, CE.
Resumo O Clostridium difficile tem sido apontado como um importante agente causador de doenças diarreicas associadas ao uso de antimicrobianos. Contudo, em razão da sua complexidade a fisiopatologia dessas doenças ainda se encontra apenas parcialmente esclarecida, muito embora, uma série de trabalhos científicos demonstrem a importância das toxinas A e B na patogênese da diarréia inflamatória induzida por esse microrganismo. Os mecanismos inflamatórios envolvidos nas atividades biológicas dessas toxinas são bastante complexos. Existem alguns estudos relatando que a toxina B é desprovida de efeitos enterotóxicos, in vivo. No entanto, essa toxina provoca, de forma dose-dependente, alterações eletrofisiológicas e morfológicas na mucosa colônica humana, in vitro. Ademais, a toxina B estimula a síntese de potentes mediadores inflamatórios, por monócitos e macrófagos. Os efeitos provocados pela toxina A sobre a mucosa intestinal são bastante evidentes e caracterizam-se por uma intensa secreção de fluidos e por um grande acúmulo de células inflamatórias, do tipo macrófagos, mastócitos, linfócitos e neutrófilos, com a conseqüente liberação de seus mediadores, tais como prostaglandinas, leucotrienos, fator de agregação plaquetária, óxido nítrico e citocinas.
Palavras-chaves: Clostridium difficile. Toxinas A e B. Diarréia. Inflamação.
Abstract Clostridium difficile has been pointed out as an important agent of diarrheal diseases associated with antibiotic use. However, due to its complexity, the physiopathology of these diseases is only partially elucidated, although a series of scientific works has demonstrated the importance of toxins A and B in the pathogenesis of the inflammatory diarrhea induced by this microorganism. The inflammatory mechanisms involved in the biological activities of these toxins are complex. There are some studies demonstrating that toxin B has no enterotoxic activity in vivo. However, this toxin causes dose-dependent eletrophysiologic and morphologic modifications of human colonic mucosa in vitro. In addition, toxin B stimulates the synthesis of potent inflammatory mediators by monocytes and macrophages. The effects provoked by toxin A on the intestinal mucosa are quite evident and are characterized by intense fluid secretion and by inflammatory cell accumulation, such as macrophages, mast cells, lymphocytes and neutrophils, with the consequent release of mediators such as prostaglandins, leukotrienes, platelet activating factor, nitric oxide and cytokines.
Key-words: Clostridium difficile. Toxins A and B. Diarrhea. Inflammation.
ABORDAGEM HISTÓRICA
Uma das primeiras descrições da colite pseudomembranosa foi feita por Finney, em 1893, a partir da observação de uma pseudomembrana, presente no cólon de uma paciente que apresentou uma colite fatal depois de uma cirurgia. Contudo, vale salientar que, o agente causador desta enfermidade não foi elucidado nesta época26.
Somente em 1935, Hall e Toole, estudando a flora intestinal de recém-nascidos saudáveis, descreveram um microrganismo, até então desconhecido, que recebeu inicialmente a denominação de Bacillus difficilis e logo em seguida de Clostridium difficile, refletindo exatamente a dificuldade encontrada para isolar e manter esse microrganismo em cultura pura. Nesse mesmo ano, Hall e Toole demonstraram, ainda, que o C. difficile era extremamente toxicogênico em cultura. Essa evidência foi baseada no achado de lesões, parada respiratória e morte quando da injeção de cultura líquida ou filtrado do meio que continha esse microrganismo, em animais experimentais26.
Depois de sua descoberta, o Clostridium difficile passou por uma relativa obscuridade, haja visto que a colite pseudomembranosa foi uma condição rara na era pré-antibiótica. Contudo, em meados dos anos 1970 e início da década de 1980, essa enfermidade atingiu proporções epidêmicas, tornando-se uma complicação comum ao uso de antibióticos21 26.
Somente por volta de 1970, as bactérias anaeróbias começaram a ser implicadas como importantes agentes causadores de doenças. Por conseguinte, surgiram vários estudos em busca de antimicrobianos ativos contra esses agentes infecciosos emergentes; tendo sido a lincomicina um dos primeiros sucessos21 26.
Entretanto, logo foi observado que muitos dos pacientes tratados com a lincomicina e seus congêneres freqüentemente apresentavam diarréia e uma severa inflamação da mucosa colônica. Dessa forma, esse antibiótico mostrava-se eficaz não somente contra as bactérias anaeróbias, mas também como um fator desencadeante da colite pseudomembranosa, possivelmente favorecendo a ativação do C. difficile que se encontrava inócuo apenas como um microrganismo da microbiota intestinal26.
A partir do final da década de setenta, o C. difficile tem sido reconhecido com freqüência cada vez maior como um importante enteropatógeno. Nesse sentido, dados epidemiológicos, nos EUA, indicam que até 1/4 dos pacientes hospitalizados albergam esse agente; e que muitos desenvolvem sintomas de diarréia e colite35 38 42. Corroborando este fato, Lima et al, 1993, demonstraram, em estudo realizado no Hospital Walter Cantídio da Universidade Federal do Ceará, Brasil, que o C. difficile é o principal agente causador de diarréia nosocomial nesse estabelecimento23.
Nos dias de hoje, há numerosos estudos laboratoriais e clínicos demonstrando que o C. difficile é o principal agente causador de doenças intestinais associadas ao uso de antimicrobianos, que variam desde diarréia autolimitada, relativamente benigna, a colite pseudomembranosa grave, que, muitas vezes, pode ser fatal21 26 40 42.
É importante ressaltar o fato de que, com o advento do uso indiscriminado de antimicrobianos, as doenças relacionadas ao C. difficile têm se tornado cada vez mais freqüentes e, dessa maneira, têm aumentado os índices de mortalidade por doenças diarréicas causadas por esse microrganismo2 6 21.
MICROBIOLOGIA
O C. difficile é reconhecido como um bacilo anaeróbio obrigatório, gram-positivo e com esporo subterminal, que faz parte da microbiota intestinal, tanto do homem como de outros animais. Esse agente produz duas toxinas denominadas toxina A (enterotoxina) e toxina B (citotoxina). Contudo, foram isoladas, em portadores humanos e animais, cepas que não produzem toxinas21 26 35.
Até por volta de 1977, era difícil se fazer a distinção entre o Clostridium difficile e outros microrganismos comumente encontrados nas fezes, como, por exemplo, o Clostridium sporogenes. Por conseguinte, as doenças associadas ao C. difficile não eram adequadamente diagnosticadas. Entretanto, George et al, 197816, desenvolveram um meio de cultura seletivo contendo cicloserina e cefoxitima e frutose em ágar, o qual facilitou sensivelmente o isolamento desse agente. Vale salientar que atualmente vários sistemas de automação estão sendo utilizados para identificação de bactérias anaeróbias, incluindo o Clostridium difficile.
Em adição, existem alguns métodos laboratoriais, do tipo ELISA, cultura de células, contraimunoeletroforese e aglutinação pelo látex, para detecção das toxinas do C. difficile. Dentre esses, o ensaio utilizando a cultura de células é considerado o método padrão e, por conseguinte, serve de parâmetro para os outros testes26.
TOXINAS
O Clostridium difficile produz duas toxinas denominadas de toxina A (enterotoxina) e toxina B (citotoxina), que possuem uma seqüência de 2710 e 2366 aminoácidos e pesos moleculares de 308 e 279 kDa, respectivamente5 10. Dentre os aminoácidos que compõem essas toxinas, a aspargina, glicina e glutamina são os que se apresentam em maiores quantidades4 5 10.
O modo de ação biológica dessas toxinas ainda é pouco compreendido, não obstante muitas publicações confirmarem sua participação efetiva, na patogênese de doenças diarréicas associadas a antibióticos. Tanto é verdade, que cepas de C. difficile que não produzem toxinas são incapazes de desenvolver as doenças diarréicas relacionadas com este microrganismo, tanto no homem como em animais experimentais3 6 21 26 35.
Ademais, tem sido relatado que é possível um amplo espectro de resposta do hospedeiro ao C. difficile, passando do estado de portador assintomático até a colite pseudomembranosa. Esta variação, ainda, não é bem compreendida e pode estar associada com diferenças entre as cepas do microrganismo, ou com variações na resposta do hospedeiro, relacionadas com modificações nos receptores das toxinas ou nas defesas imunológicas21 35.
DOENÇAS RELACIONADAS
A diarréia associada a antibióticos e/ou a colite pseudomembranosa, tanto em animais como no homem, tem sido comumente relacionada ao Clostridium difficile toxigênico numa freqüência de 50 a 80%, para diarréia associada a antibióticos, e 90 a 100% para colite pseudomembranosa6 16 21.
A flora intestinal, tanto do homem como dos animais, quando íntegra, impede eficazmente a colonização pelo C. difficile. Contudo, os antibióticos constituem o principal fator de alteração da microbiota bacteriana, provocando a sua substituição por microrganismos resistentes às drogas em uso, os quais proliferam e podem provocar quadros patológicos diversos. O desequilíbrio da microbiota intestinal se manifesta especialmente com o surgimento de diarréia, ou até mesmo com um quadro grave de colite pseudomembranosa provocada pelo Clostridium difficile 21 35 40.
Em geral, esse quadro clínico produzido pelo C. difficile ocorre em pacientes que tiveram a sua flora intestinal anaeróbia alterada por antibióticos, do tipo clindamicina, ampicilina, amoxicilina, macrolídeos, lincosamidas, aminoglicosídios, cefalosporinas etc21 35.
A colite pseudomembranosa caracteriza-se por uma severa inflamação da mucosa colônica e pela formação de uma pseudomembrana composta de fibrina, muco, células epiteliais necrosadas e leucócitos16 18 29. Esta enfermidade é diagnosticada pela observação endoscópica da pseudomembrana ou pela presença de microabcessos no cólon de pacientes com diarréia, e com história de exposição a antibiótico/quimioterápicos, nas últimas 6-8 semanas18 21.
Outra forma de manifestação da infecção pelo Clostridium difficile é o surgimento de diarréia leve a moderada, denominada diarréia associada a antibióticos. Em geral, esse distúrbio é menos grave e de tratamento mais fácil do que a forma clássica de colite pseudomembranosa21 26 35.
ATIVIDADES BIOLÓGICAS DAS TOXINAS A E B
Nos últimos anos, vários pesquisadores têm se empenhado na investigação dos mecanismos moleculares, envolvendo as toxinas A e B do Clostridium difficile. Por conseguinte, surgiram vários trabalhos evidenciando o fato de que ambas as toxinas são capazes de monoglicosilar proteínas Rho, pertencentes à família de GTPases de baixo peso molecular9 17 19 20 39.
O mecanismo pelo qual a glicosilação de proteínas Rho provoca inativação molecular ainda não foi bem esclarecido. Entretanto, sabe-se que esse efeito se encontra relacionado, pelo menos em parte, com alterações na transdução de sinal19 39. Vale salientar que essa glicosilação de proteínas Rho, além de inativar várias atividades biológicas de determinadas moléculas, também é capaz de intermediar alguns eventos celulares produzidos por toxinas bacterianas1. Ratificando essa evidência foi demonstrado que os mecanismos de apoptose, alterações no citoesqueleto e inibição da fosfolipase D, provocados pelas toxinas A e B são dependentes da inativação de proteínas Rho 17 19 20 39.
As toxinas do C. difficile, especialmente a toxina B, causam arredondamento celular e marginalização do núcleo. Essas mudanças morfológicas, geralmente, são irreversíveis e inibem a divisão celular. Dessa maneira, essas toxinas mostram uma atividade antiproliferativa12. Em adição, há estudos demonstrando que a toxina B causa uma série de efeitos inespecíficos em células de mamíferos, tais como perda de potássio e cálcio intracelulares e diminuição na síntese de ácido ribonucléico e desoxirribonucléico com a conseqüente redução na síntese protéica14.
A literatura relata que a toxina B é desprovida de efeitos enterotóxicos, ou seja, não é capaz de provocar secreção de fluidos, lesão morfológica, nem infiltrado inflamatório na mucosa intestinal, in vivo 27. Por outro lado, Riegler et al36, demonstraram que essa toxina provoca, de forma dose-dependente, alterações eletrofisiológicas e morfológicas na mucosa colônica humana, montada em câmaras de Üssing36. Ademais, a toxina B é cerca de mil vezes mais potente que a toxina A, no que diz respeito aos seus efeitos citotóxicos, para vários tipos de células de mamíferos em cultura3 26.
Recentemente, o nosso grupo de pesquisa demonstrou que as toxinas A e B do Clostridium difficile são potentes indutoras da migração de neutrófilos, em cavidade peritoneal e bolsa de ar subcutânea de ratos, dependentemente da presença de macrófagos37 41. Ademais, foi evidenciado que ambas as toxinas são capazes de estimular macrófagos, in vitro, a liberar potentes mediadores inflamatórios, tais como, leucotrienos e citocinas31 37 41.
Essas evidências estão fundamentadas nos seguintes fatos: a) o aumento da população de macrófagos, pelo tratamento com tioglicolato, amplificou o efeito da migração de neutrófilos; b) a depleção de células peritoneais residentes, por meio da lavagem peritoneal, inibiu essa atividade; c) o tratamento dos animais com inibidores específicos de lipoxigenase, tais como MK 886 e BWA4C, também, bloqueou o referido evento; d) a incubação de soros anti-TNF-a e anti-IL-1b com toxina A neutralizou a capacidade dessa toxina em promover infiltração de neutrófilos, em bolsas de ar subcutâneas. Evidenciou-se, ainda, que somente o soro anti-TNF-a inibiu essa atividade quando o estímulo inflamatório foi a toxina B; e e) Por fim, demonstrou-se que monocamadas de macrófagos estimulados com toxina A ou B foram capazes de liberar, no sobrenadante da cultura, fatores quimiotáticos para neutrófilos, in vivo31 37 41.
Em adição, foi demonstrado que a toxina A é capaz de estimular a síntese e a liberação de IL-1, por macrófagos em cultura, que, por sua vez, é capaz de induzir a proliferação de linfócitos32. Além do mais, Flegel et al13, evidenciaram que ambas as toxinas do C. difficile são potentes estimuladoras da liberação de TNF-a, IL-1 e IL-6, por monócitos humanos, in vitro.
Está bem demonstrado em animais experimentais que a toxina A, através de seus efeitos enterotóxicos, é capaz de produzir uma intensa secreção de fluidos, aumento da permeabilidade intestinal e uma potente reação inflamatória aguda na mucosa intestinal, caracterizada por necrose epitelial, edema hemorrágico, ulceração e ativação de macrófagos e mastócitos, com a subseqüente mobilização de neutrófilos para o foco inflamatório7 21 22 24 27 28 43.
Corroborando esse fato, Lima et al24, demonstraram que a injeção de toxina A em alça intestinal de coelho, a partir de 2h, provoca uma significativa infiltração de células mononucleares e uma potente secreção intestinal semelhante àquela produzida pela toxina do Vibrio cholerae. Outros pesquisadores, desse mesmo grupo, evidenciaram ainda que esta secreção vem acompanhada por uma excessiva reação inflamatória, as quais foram bloqueadas por inibidores de fosfolipase A2, de ciclooxigenase e por antagonistas do fator de agregação plaquetária11 15.
O resultado da inflamação intestinal provocada pela toxina A, no intestino de coelho, é um acentuado influxo de neutrófilos com a conseqüente destruição da mucosa intestinal7 21 35. Essa lesão celular é mais grave na extremidade da vilosidade, porém, toda a mucosa é envolvida por uma intensa reação inflamatória com áreas de necrose35. Ademais, por meio desse mesmo protocolo, observou-se que, diferentemente da toxina da cólera que provoca secreção de fluidos acelulares e ricos em proteínas, a toxina A induz um potente efeito secretório intestinal caracterizado pela presença de exsudato que contém neutrófilos, monócitos e enterócitos descamados35 43.
Os mecanismos envolvidos na resposta inflamatória da toxina A são complexos e envolvem, pelo menos em parte, a liberação de potentes mediadores inflamatórios, do tipo prostaglandina E2, e leucotrieno B4, leucotrieno C4, fator ativador de plaquetas, interleucina-1, interleucina-8, histamina e óxido nítrico, por células residentes da lâmina própria intestinal7 25 29 32 43.
Os mastócitos, da mesma forma que os macrófagos, têm sido implicados nas ações biológicas da toxina A. Nesse sentido, foi observado que a injeção desta toxina, na alça intestinal de coelho, induz um aumento na produção de histamina e LTC4 que são sintetizados especialmente por mastócitos25. Observou-se, também, que o ketotifen (estabilizador de mastócitos) reduz a lesão, secreção de fluidos, permeabilidade intestinal e níveis de PAF, LTC4 e LTB4provocados pela toxina A no íleo de ratos34. Foi relatado, ainda, que essa toxina causa a liberação de uma protease específica, denominada RMCPII, por mastócitos da lâmina própria intestinal, que pode ser bloqueada pelo ketotifen8 30 33 34, reforçando, portanto, a participação dos mastócitos residentes da lâmina própria intestinal na enterotoxicidade da toxina A. Por outro lado, recentemente o nosso grupo demonstrou que essas células não participam do evento da migração de neutrófilos provocada pelas toxinas A e B37 41.
Em resumo, fazendo-se uma análise global dos trabalhos ora discutidos, podemos concluir que os efeitos deletérios das toxinas A e B do Clostridium difficile sobre a mucosa intestinal, resultam de mecanismos indiretos mediados em parte por células inflamatórias, em especial macrófagos, mastócitos e neutrófilos, que, por sua vez, participam da fisiologia e imunofarmacologia do epitélio intestinal através da síntese e liberação de potentes mediadores pró-inflamatórios.
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Departamento de Medicina Veterinária da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará. Laboratório de Micologia Médica do Depto de Patologia e Medicina Legal, Unidade de Pesquisas Clínicas e Deptº de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, CE.
Endereço para correspondência: Dr. José Júlio C. Sidrim. Laboratório de Micologia Médica, Deptº de Patologia e Medicina Legal/UFC. R. Monsenhor Furtado s/nº; Rodolfo Teófilo. Caixa Postal 3163, 60441-750, Fortaleza, CE, Brasil.
Tel: 55 85 243-9301; Fax 55 85 295-1736
Recebido para publicação em 15/07/98.
