Vânia Noronha, Wyller Mello, Luísa Villa, Arival Brito, Roberto Macêdo, Fátima Bisi, Rosilda Mota, Kyio Sassamoto, Talita Monteiro e Alexandre Linhares
Instituto Evandro Chagas (IEC), Instituto Ofir Loiola (IOL), Núcleo de Medicina Tropical da Universidade Federal do Pará (NMT/UFPA), Belém, PA, Brasil. Instituto Ludwig de Pesquisas sobre o Câncer, São Paulo, SP, Brasil.
Resumo Estudou-se a prevalência do papilomavírus humano (HPV) em 228 mulheres portadoras de lesões em cérvice uterina, atendidas no Instituto Ofir Loiola, em Belém, Pará, no período de março de 1992 a maio de 1996. As pacientes foram submetidas à biópsia de colo uterino, sendo o material encaminhado para histopatologia e pesquisa de HPV por PCR e hibridização por dot-blot. Distribuíram-se as participantes em três grupos, conforme diagnóstico histopatológico. O grupo A constituiu-se de 155 mulheres com carcinoma epidermóide invasor ou com adenocarcinoma, o grupo B de 54 portadoras de neoplasia intra-epitelial cervical grau II ou III, e o grupo C de 19 pacientes com cervicite crônica. Observaram-se prevalências de HPV em 70,3%, 63,0% e 36,8% das mulheres dos grupamentos A, B e C, respectivamente, sendo o HPV 16 registrado em 60,4% das amostras positivas do grupo A e 54,5% daquelas do grupo B. Os tipos 16, 18 e 33 representaram 71,4% dos detectados no grupo C.
Palavras-chaves: Papilomavírus humano. HPV. Cérvice uterina. Carcinoma cervical. Neoplasia inraepitelial cervical
Abstract It was studied the prevalence of human papillomavirus (HPV) among 228 women with lesions of uterine cervix attending the Ofir Loiola Institute, in Belem, Para, from March 1992 to May 1996. Histopathological examination was performed with all cervical biopsy samples obtained from these patients. In addition, specimens were analysed by both polimerase chain reaction and dot-blot hybridization to detect HPV DNA. The patients were assigned to three groups, according to the diagnosis made by histopathology, as follows: A, including 155 women suffering from invasive epidermoid carcinoma or adenocarcinoma; B, 54 patients having either cervical intraepithelial neoplasia grade II or III; and C, involving 19 women with chronic cervicitis. The prevalence rates of HPV in groups A, B and C were 70.3%, 63% and 36.8% respectively. HPV 16 accounted for 60.4% and 54.5% of types identified in groups A and B, respectively. Altogether HPV types 16, 18 and 33 were detected in 71.4% of positive patients belonging to group C.
Key-words: Papillomavirus. HPV. Uterine cervix. Cervical carcinoma. Cervical intraepithelial neoplasia.
Acredita-se que a infecção viral mais freqüentemente transmitida por via sexual seja aquela provocada pelo HPV2 12, originando também uma das mais prevalentes entre todas as doenças sexualmente transmissíveis.
A importância que assume hoje a nível mundial o estudo dos HPV vem de sua nítida correlação com os processos malignos e lesões precursoras em cérvice uterina.
Os papilomavírus (PV) são um dos dois gêneros da família Papovaviridae. Classificam-se de acordo com sua espécie de origem (humana, bovina, etc) e conforme a homologia existente entre o material genético de vírus da mesma espécie. Atualmente, estão identificados mais de 70 tipos distintos de HPV16, sendo que cerca de 35 infectam o trato genital8.
O câncer cervical, com uma incidência mundial de cerca de 500.000 casos por ano1 11, constitui-se em um dos mais graves problemas de saúde pública, especialmente para os países em desenvolvimento1, dentre os quais o Brasil, onde se estima que cerca de 40.000 casos novos surjam anualmente26.
Evidências demonstram que as mulheres portadoras de certos tipos de HPV, especialmente o 16 e o 18, apresentam risco significativamente maior de desenvolver processo maligno em cérvice uterina quando comparadas àquelas sem sinais de infecção por esses agentes virais14 24.
Com base no exposto, tornou-se premente a realização deste estudo cujo objetivo foi determinar a prevalência e identificar os tipos de HPV mais freqüentes em mulheres com lesões de cérvice uterina, agrupadas segundo diagnóstico histopatológico, em Belém, Pará.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram testadas 228 amostras de cérvice uterina provenientes de biópsias de mulheres atendidas no Instituto Ofir Loiola (IOL), em Belém (Pará), no período de março/1992 a maio/1996, com suspeita clínica e/ou laboratorial (citologia) de processo maligno em região cervical e sem história de terapêutica antineoplásica. As coletas ocorreram após assinatura de termo de consentimento por parte das pacientes.
Os espécimes coletados foram armazenados em formol tamponado para posterior diagnóstico histopatológico no IOL, e em baixas temperaturas, inicialmente em nitrogênio líquido e a seguir em freezer, objetivando diagnóstico pela técnica de PCR no Instituto Evandro Chagas (IEC), Belém (Pará), e hibridização por dot-blot no Instituto Ludwig de Pesquisas sobre o Câncer, São Paulo (São Paulo).
As pacientes foram distribuídas em 3 grupos (A, B e C), conforme diagnóstico histopatológico. Do grupo A (155/228) fizeram parte aquelas com adenocarcinoma (5/155) ou com carcinoma epidermóide invasor (150/155). As com neoplasia intra-epitelial grau II (1/54) ou III (53/54) (NIC II ou NIC III) foram incluídas no grupo B (54/228), e as com cervicite crônica constituíram o grupo C (19/228). A idade das mulheres variou de 16 a 86 anos, com médias de 51,5 (grupo A), 43,6 (grupo B) e 44,3 (grupo C).
A técnica de PCR utilizada baseou-se na descrição de Manos et al17, utilizando-se primers genéricos MY09 e MY11, que detectam ampla faixa dos diferentes tipos de HPV em uma área bem delimitada de seus genomas (região L1). Como controle de qualidade utilizaram-se primers capazes de amplificar um fragmento do gene de globina humana. Em todos os ensaios foram empregados controles positivos (células He-La ou células Caski) e negativos (água).
A reação foi efetuada acrescentando-se a 1µl de cada amostra do DNA a ser testado, 49µl de uma mistura (MIX) cuja composição era: 5,00µl de cada um dos 4 trifosfatos de desoxinucleotídeo, 1,00µl de cada primer para HPV (MY09 e MY11), 0,50µl de cada primer de globina G73 e G74, 0,25µl de Taq DNA polimerase, 5,00µl de solução tampão [100mM Tris-Hcl (pH:9), 500mM KCl, 30mM MgCl2] e 35,75µl de água bidestilada, completando assim um volume total de 50µl. As misturas foram, em seguida, submetidas a 33 ciclos de amplificação em aparelho ciclador de temperatura (94oC por 1 min, 55oC por 1 min, 72oC por 2 min, seguidos ao final por 10 min a 72oC).
Após eletroforese em gel de agarose a 2%, os produtos da PCR foram corados em solução de brometo de etídio e visualizados à luz ultravioleta.
A técnica de hibridização por dot-blot baseou-se na descrição de Manos et al17, com modificações. Utilizaram-se oligonucleotídeos específicos tornados radioativos pela incorporação de P32, em uma reação que envolveu a T4 polinucleotídeoquinase. Empregaram-se sondas específicas para os seguintes tipos de HPV: 5, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 66, 68, 70, 72, 73, Pap.155, Pap.291, W13B (os três últimos são tipos ainda não classificados) e sonda genérica.
A décima parte do volume da reação de PCR foi desnaturada em placa de ELISA com hidróxido de sódio. A mistura foi pipetada sobre uma membrana de náilon ajustada a uma placa de acrílico (dot-machine), ligada constantemente ao vácuo. A membrana foi removida e colocada sobre um papel de filtro para marcar as posições das amostras. Fixou-se o DNA expondo a membrana à luz ultravioleta por 5 minutos. A membrana foi colocada em saco plástico com a seguinte solução de hibridização: [6x solução citrato salina padrão (SSC): (NaCl ® 900mM, Na citrato ® 90mM); 10 x Denhardt’s: (0,2% de soro de albumina, 0,2% de polyvinylpirrolidona, 0,2% ficoll); 0,5% de SDS, 100µg/ml de esperma de salmão desnaturado] e incubou-se por 3h a 56oC. A seguir a sonda radioativa foi acondicionada no interior do saco plástico junto com a solução de hibridização e incubada por 12-18 horas a 56oC, após o que as membranas foram removidas do saco plástico e lavadas a temperatura ambiente por duas vezes, por 15 minutos cada, seguindo-se duas vezes a 56oC por 20 minutos, com uma solução de 2 x SSC e 0,1 SDS. No final as membranas foram expostas a filmes de raio X por períodos de 12 a 24h.
A tipagem dos HPV foi realizada nas amostras que amplificaram ou não 450 pares de bases da região L1 dos HPV.
RESULTADOS
Todas as amostras foram testadas por PCR, enquanto que pela hibridização por dot-blot analisaram-se 147 (de um total de 150) no grupo A, 49 (das 54) no grupo B e 17 (das 19) no grupo C.
Consideraram-se positivas para HPV as amostras nas quais a presença do vírus foi detectada por ambas as técnicas (136/150), aquelas positivas por dot-blot e negativas por PCR (10/150), e as positivas por PCR e não testadas por dot-blot (4/150), conforme pode ser observado na Tabela 1.
A prevalência de HPV foi de 70,3% (109/155) no grupo A, 63,0% (34/54) no B e 36,8% (7/19) no C (Tabela 2). Verifica-se ainda, na mesma tabela, que o grupo A se constituiu predominantemente de mulheres com diagnóstico histopatológico de carcinoma epidermóide invasor (150/155), enquanto que o grupamento B foi representado quase que exclusivamente por pacientes com NIC III (53/54).
A figura 1 demonstra que nas 106 amostras pertencentes a mulheres do grupo A em que o HPV foi detectado por dot-blot, encontrou-se nítido predomínio do tipo 16 com 60,4% do total (64/106); o HPV 18 contribuiu com 11,3% (12/106), incluindo-se neste grupo um espécime que foi simultaneamente positivo para HPV 6, 11 e 18. Os HPV 31, 33, 45, 52, 58, 59, 73 representaram, em conjunto, 18,9% (20/106), sendo que o HPV 73 contribuiu com apenas 0,9% (1/106) e, em 9,4% (10/106) houve reação positiva na sonda genérica, significando, provavelmente, a presença de outros tipos de HPV para os quais sondas moleculares específicas não estão disponíveis.
Nas 33 amostras do grupo B em que a hibridização por dot-blot demonstrou a presença do vírus, observa-se (figura 2) que o HPV 16 representou 54,5% (18/33), o HPV 18 apenas 3% (1/33); os tipos 31,33 e 58 concorreram com 21,2% (7/33); e, em 21,2% (7/33) a presença de HPV foi detectada somente pela sonda genérica.
No grupo C, das 7 amostras positivas por dot-blot, 5 (71,4%) pertenciam aos seguintes tipos: 16, 18 ou 33, enquanto a sonda genérica mostrou-se positiva em 2 casos (dados não exibidos em figura).
DISCUSSÃO
O percentual de HPV detectado em amostras de mulheres com carcinoma de colo uterino no presente estudo está em concordância com o referido pela literatura especializada que situa a prevalência na faixa de 70 a 90% quando utilizadas técnicas laboratoriais similares, em sensibilidade, às empregadas neste estudo. De Brinton et al7 e Muñoz et al19, por meio da metodologia de PCR, em espécime clínico obtido por meio de biópsia de cérvice uterina, apresentaram resultados que consubstanciam nossos dados. Percentuais dentro dos mesmos níveis foram também encontrados em material coletado por meio de esfregaços ou raspagens de região cervical uterina4 10.
O grupo B, constituído quase que exclusivamente de mulheres diagnosticadas como portadoras de NIC III (apenas uma possuía NIC II), apresentou 63% de amostras positivas para HPV (Tabela 2). Estabelecendo comparação com o trabalho de Muñoz et al19, verificamos que esses autores encontraram prevalências de 70,7% e 63,2% em pacientes com carcinoma in situ estudadas na Espanha e Colômbia, respectivamente.
Cumpre ressaltar que as alterações designadas como carcinoma in situ e displasia severa21, em virtude do elevado grau de dificuldade na distinção histológica que por vezes apresentam, passaram a ser mais freqüentemente agrupadas sob a denominação de NIC III22, daí a comparação estabelecida entre os resultados locais e aqueles de Muñoz et al19.
É pertinente comentar que resultados positivos superiores a 90% já foram detectados. Liaw et al15, em amostragem agrupando mulheres com NIC II, NIC III e carcinoma invasivo revelaram prevalência de 92%, utilizando amostras coletadas por raspagens de cérvice uterina. Na Hungria, Kónya et al13 registraram presença de HPV em 98% das amostras, obtidas por meio de biópsia, de pacientes com carcinoma cervical invasivo. Em estudo3 realizado com mais de 1.000 espécimes clínicos oriundos de mulheres com carcinoma invasivo de colo uterino, residentes em 22 países, encontrou-se DNA de HPV em 93% das amostras, não sendo registrada diferença significativa entre os resultados positivos dos diversos países3.
A caracterização antigênica dos HPV, revelando nítida predominância do tipo 16 em lesões neoplásicas, foi de cardinal importância (figura 1 e figura 2), pois demonstrou que os achados em nossa região corresponderam aos que vêm sendo registrados por diversos autores em áreas geográficas distintas10 19. Estudo realizado em Barbados20 com 20 mulheres portadoras de carcinoma em região cervical (19 das quais em cérvix uterina), demonstrou presença de HPV 16 em 65% dos casos. A pesquisa de Bosch et al3, já referida anteriormente, detectou que 50% das amostras testadas foram positivas para HPV 16.
Ainda em relação aos tipos de HPV, notamos que cerca de 90% e 79% dos identificados nos grupos A e B, respectivamente, são considerados de risco para processos malignos e lesões precursoras em região cervical15. Nesse contexto, nossos percentuais situam-se entre os de Eluf-Neto et al10 e Liaw et al15. Os primeiros registraram que entre mulheres com carcinoma cervical uterino e portadoras de HPV, o percentual de amostras positivas para os tipos 16, 18, 31, 33, foi de 78%. O segundo trabalho, efetuado em grupamento de pacientes com diagnóstico de NIC II, NIC III e carcinoma invasor, demonstrou que aquelas positivas para HPV estavam infectadas com tipos considerados de risco para progressão oncogênica em 98% dos casos.
O registro de amostras positivas com a sonda genérica, que correspondeu a 9,4% e 21,2% nos grupos A e B, respectivamente (Figuras 1 e 2), sugere o envolvimento de outros tipos de HPV cujas sondas moleculares não estão disponíveis.
Vale destacar nesta investigação a presença relativamente elevada de HPV considerados de alto risco (para o desenvolvimento de lesão maligna em colo de útero), em mulheres com diagnóstico histopatológico de cervicite crônica, embora a detecção de HPV em pacientes com alterações mínimas e mesmo sem alterações de colo uterino, não se constitua em um achado extraordinário5 6 9 15 18 25. Roteli-Martins et al23 detectaram prevalência de HPV com potencial oncogênico em 38% das amostras com diagnóstico histopatológico de cervicite. Em nossa casuística o percentual de HPV foi de 37% (7/19), sendo que em 26% (5/19) os tipos corresponderam aos associados a processos carcinogênicos e em 11% (2/19) não foi possível identificar-se o HPV presente no material examinado, logo se levarmos em conta apenas aqueles em que o HPV foi detectado (7/19), verificaremos que em 71% (5/7) deles confirmou-se tipos relacionados a processos malignos.
Acreditamos que os resultados aqui discutidos reforçam a correlação entre certos tipos de HPV, especialmente o 16, no desenvolvimento de lesão maligna de cérvice uterina.
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Endereço para correspondência: Dra. Vânia Noronha. Instituto Evandro Chagas. Av. Almirante Barroso 429, Marco, 66090-000 Belém, PA, Brasil.
Fax: 55 91 266-46-69 ou 226-1284.
Recebido para publicação em 28/4/98.
