Márcia Cristina Ribeiro Andrade, Alexandre Nunes de Oliveira, Phyllis Catharina Romijn e Leda Maria Silva Kimura
Laboratório de Biologia Animal - Empresa de Pesquisa Agropecuária do Estado do Rio de Janeiro, Niterói, RJ, Brasil.
Resumo Visando avaliar a resposta imunológica produzida por vacinas anti-rábicas em primatas não humanos neotropicais, trinta sagüis (Callithrix sp) foram divididos em cinco grupos de seis indivíduos e submetidos a cinco diferentes esquemas de vacinação anti-rábica, utilizando-se duas vacinas animais distintas existentes no mercado. A primeira produzida em cérebro de camundongos lactentes (Fuenzalida e Palacios), e a segunda, em cultura de células NIL-2. Acompanhamento sorológico pós-vacinal foi realizado periodicamente. Os resultados mostraram que a vacina Fuenzalida e Palacios não foi eficaz para a proteção dos animais, utilizando-se uma única dose ou mesmo com o reforço. Porém, os sagüis apresentaram anticorpos detectáveis, ao adotar-se o esquema semelhante ao de pré-exposição indicado para os seres humanos, e apenas um animal contraiu raiva após o desafio viral. Por outro lado, a vacina produzida em cultura de células NIL-2 produziu elevados títulos de anticorpos em todos os animais imunizados e todos os animais resistiram ao desafio viral.
Palavras-chaves: Raiva. Vacina. Imunização. Sagüi. Callithrix sp.
Abstract In order to evaluate the immune response produced by rabies vaccines in new world nonhuman primates, thirty marmosets (Callithrix sp) were divided into five groups of six individuals and submitted to five different antirabies vaccination schemes using two distinct commercially available animal vaccines. The first was produced in suckling mouse brain (Fuenzalida and Palacios), and the second in NIL-2 cell culture. Post-vaccine serological monitoring was carried out periodically. The results showed that the Fuenzalida and Palacios vaccine was not able to protect the animals when using a single dose or even with a booster. But when submitted to a vaccination routine similar to that used for humans, the marmosets showed detectable antibodies, and only one succumbed to rabies after being challenged. In addition, the vaccine produced in NIL-2 cell culture induced high antibody levels in all vaccinated animals and all animals survived the viral challenge.
Key-words: Rabies. Vaccine. Immunization. Marmoset. Callithrix sp.
Dentre as numerosas zoonoses conhecidas, a raiva é considerada uma das mais importantes, devido ao seu desenlace invariavelmente fatal24. Assim, todos os cuidados devem ser tomados a fim de que se possa preservar as espécies suscetíveis e a sua profilaxia é a adoção mais importante, seja pelos aspectos de saúde pública, seja pelos aspectos econômicos. Atualmente, são adotados programas de controle da raiva através de rotinas de vacinação anual dos animais domésticos. Os animais silvestres, no entanto, se encontram permanentemente expostos aos riscos de uma infecção nas áreas endêmicas. Em muitos países, a raiva canina tem sido controlada pela imunização maciça, consistindo em um processo bastante satisfatório. Todavia, a imunização de animais selvagens em vida livre torna-se complexa.
Apesar de proibições por lei no que se refere à manutenção de animais silvestres em cativeiro, atualmente no Brasil vem crescendo nos grandes centros urbanos, o hábito de se criar animais selvagens como animais de estimação e, dentre os mamíferos, os sagüis são os exemplares silvestres mais cobiçados, o que é possível de ser constatado pela sua presença freqüente nas campanhas de vacinação anti-rábica destinada a cães e gatos.
Os símios são transmissores de diversas doenças e o seu convívio com o ser humano é extremamente arriscado, pois albergam uma grande gama de vírus e bactérias e são altamente suscetíveis a infecções comuns ao homem. Inúmeras pessoas, em todo o mundo, já receberam tratamento anti-rábico como resultado da exposição a macacos raivosos8. No Estado do Ceará, é comum os sagüis criados como animais de estimação, tendo sido registrados inúmeros casos de agressões, sendo responsáveis por seis casos de raiva humana no período de 1989 a 1996 (NB Moraes: dados não publicados). Deste modo, surge a necessidade de proteger esses animais contra as diversas zoonoses conhecidas, entre elas a raiva, na tentativa de assegurar a saúde destes e do homem. A vacinação profilática poderia cumprir este papel, se comprovada sua eficiência nesses animais. No Brasil, a vacina anti-rábica animal utilizada nas campanhas de vacinação é a do tipo Fuenzalida e Palacios12 e a sua eficácia em sagüis permanece desconhecida.
A vacina anti-rábica com vírus vivo modificado pode promover o desenvolvimento da doença em primatas não humanos. As vacinas inativadas são seguras, mas sua eficácia é desconhecida. Muitas vacinas anti-rábicas são licenciadas para uso subcutâneo em animais domésticos nos Estados Unidos da América, mas nenhuma delas está atualmente aprovada para primatas não humanos8 15.
A raiva silvestre é mantida entre os animais selvagens sem interferir com o homem e os animais domésticos, sendo os mamíferos selvagens reservatórios desta zoonose, que é uma ameaça crescente para a espécie humana em todo o mundo3. Os símios têm sido, há anos, atração popular em circos e zoológicos, por sua semelhança comportamental e física com o homem, e tornaram-se também, populares como animais de estimação. Infelizmente eles dividem muitas doenças com o homem e, por isso, representam risco potencial para a saúde pública10. Quando do manuseio com qualquer animal de sangue quente que tenha tendência para morder, a raiva deve ser sempre considerada. Claramente, os macacos se enquadram nessa categoria8.
Em primatas não humanos, a raiva pode manifestar-se sob as formas furiosa e paralítica5. Macacos rhesus apresentaram a raiva do tipo furiosa e posteriormente do tipo paralítica7. Os sintomas da enfermidade em primatas não humanos são caracterizados principalmente por hidrofobia e paralisia, mas um animal pode se tornar agressivo e morder, se provocado. Os mais freqüentes sintomas clínicos da raiva paralítica em macaco são salivação, automutilação e paralisia ou morte súbita15.
Com o intuito de obter subsídios para um controle sanitário eficaz no sentido de impedir a difusão da raiva para o homem quando do seu contato com os sagüis, este trabalho teve o objetivo de determinar a resposta imunológica humoral produzida por vacinas anti-rábicas, em primatas não humanos do gênero Callithrix, através de uma análise do perfil sorológico de animais primovacinados, e posterior desafio viral.
MATERIAL E MÉTODOS
Animais. Foram utilizados sessenta sagüis (Callithrix sp) adultos, de ambos os sexos, sem histórico vacinal e sem anticorpos anti-rábicos detectáveis, doados por várias instituições de pesquisa. Foram alojados em gaiolas individuais numeradas, identificados por colar e tatuagem. Inicialmente, permaneceram em quarentena, sendo vermifugados e sangrados para verificar a presença de anticorpos anti-rábicos.
Vírus. Utilizou-se o vírus fixo CVS-31 (Challenge Virus Standard), 5ª passagem, proveniente do laboratório de Raiva do Instituto Municipal de Medicina Veterinária Jorge Vaitsman (IMMVJV) / RJ, com título viral de 10-5,61 , calculado de acordo com Reed e Muench (1938)18.
Vacinas.
. Vacina produzida em cérebro de camundongos lactentes (2% p/v), amostra CVS, inativada pela beta-propiolactona, Fuenzalida e Palacios, produzida pelo Instituto de Tecnologia do Paraná;
. Vacina produzida em cultura de células NIL-2 (feto de hamster), inativada e adjuvada com hidróxido de alumínio, fornecida pelo Laboratório Rhodia Merieux de Paulínia, SP.
O controle de qualidade das vacinas estudadas foi realizado através do teste Habel (1976)9. A vacina Fuenzalida e Palacios apresentou o título de 10-3,46, que protegeu os camundongos vacinados contra o desafio >2.884 DL50. A vacina produzida em células NIL-2 apresentou título de 10-4,40, protegendo os camundongos vacinados contra um desafio viral de 25.119 DL50.
Imunização. Grupos vacinados. Adotou-se cinco esquemas diferentes (Tabela 1). Os sagüis foram divididos em cinco grupos, sendo cada um constituído de seis indivíduos. Cada dose administrada foi de 1,0ml por via subcutânea.
Grupos controle (animais não vacinados). Seis animais destinados ao controle negativo (grupo 6), que não foram vacinados nem inoculados com o vírus rábico e seis animais destinados ao controle positivo (grupo 7), inoculados com o vírus rábico e não vacinados.
Coleta e manipulação das amostras sorológicas. Os animais, previamente anestesiados com Cloridrato de Ketamina (15mg/kg), foram submetidos à coleta de sangue pela veia femoral. De cada animal, foi coletada uma amostra com cerca de 1,5ml de sangue e após a retração do coágulo, as amostras foram centrifugadas. Os soros obtidos tiveram o complemento inativado em banho maria a 56ºC por 30 minutos, estocados e conservados a -20ºC. Os exames sorológicos foram realizados pelo Teste de Neutralização em camundongos (TNC)1.
Para os grupos 1 e 2, realizou-se sangrias nos dias 0, 7, 14, 21, 28, 45, 65, 80 e 95 após a primeira dose vacinal. No grupo 3, os animais foram sangrados nos dias 0, 15, 30, 37 e 45. Nos grupos restantes, os animais foram sangrados nos dias 0, 7, 14, 21, 28 e 45.
Determinação da dose letal. Para estipular a DL50 do vírus rábico para a espécie animal utilizada nos experimentos, adotou-se o padrão recomendado pela Organização Mundial de Saúde para camundongos13. Utilizou-se uma suspensão viral com título de 10-5,61, correspondendo a 40,74DL50. Os animais utilizados para o desafio com o vírus rábico foram anestesiados e, após trepanação do crânio, inoculados com a suspensão viral, considerada DL50, diretamente no córtex frontal esquerdo.
Diagnóstico de raiva. A confirmação laboratorial do óbito causado pela infecção do vírus rábico foi feita através da prova de imunofluorescência direta (IFD)11, prova biológica27 e exame histopatológico do material encefálico14.
RESULTADOS
Manifestação da raiva nos animais. Os animais que demonstraram sinais clínicos sugestivos de raiva, tiveram um período de incubação compreendendo de 4 a 8 dias, apresentando sintomas característicos da doença, compreendendo: incoordenação motora, debilidade, prostração, inapetência, hiperexcitabilidade (87,5% dos animais), opstótono (75%) e vômito (10%). Não foi verificada febre, com 71% dos animais acometidos revelando quadro de hipotermia e os demais permanecendo com a temperatura corporal normal. Invariavelmente, todos eles apresentaram paralisia de membros posteriores e de cauda, culminando em respiração marcadamente abdominal até o óbito, que variou de 3 a 6 dias a partir do aparecimento dos sintomas.
Diagnóstico de raiva. Todos os cérebros examinados dos animais que apresentaram sinais clínicos sugestivos de encefalite viral, foram positivos tanto pela técnica de IFD quanto pela prova biológica.
Patologia. Macroscopicamente, os animais acometidos de raiva apresentaram moderada congestão cerebral, gases intestinais, fezes endurecidas na porção distal do intestino e bexiga repleta de urina, em maior ou menor intensidade. Microscopicamente, evidenciou-se predomínio de infiltrados inflamatórios constituídos de células mononucleares.
Estudo sorológico. Grupo 1. Apenas um animal apresentou título detectável pelo TNC, tendo um pico máximo com título de 1:11, aos 65 dias (Tabela 2).
Grupo 2. Dos seis animais que receberam reforço vacinal aos 28 dias após a primeira dose, apenas dois apresentaram título detectável, sendo o título máximo obtido de 1:55 pelo TNC (Tabela 3).
Grupo 3. Todos os animais que receberam doses de acordo com o esquema de vacinação semelhante ao de pré-exposição adotado para humanos, mostraram anticorpos detectáveis. Aos 45 dias, todos eles apresentaram títulos, sendo o máximo de 1:183 (Tabela 4).
Grupos 4 e 5. O grupo imunizado com a vacina produzida em células NIL-2 revelou anticorpos detectáveis a partir do 14º dia e elevados títulos foram encontrados nas semanas subseqüentes estudadas (Tabela 5). Os animais pertencentes ao grupo 5, que receberam uma dose e um reforço aos 28 dias, constituíram um perfil sorológico semelhante ao encontrado no grupo 4 (Tabela 6).
Grupos controle (6 e 7). Nenhum animal pertencente aos grupos controle apresentou anticorpos anti-rábicos detectáveis pela técnica empregada no decorrer do experimento.
Desafio viral. Os grupos 1 e 2 foram desafiados aos 95 dias após a primeira dose de vacina, enquanto que os demais grupos foram inoculados aos 45 dias. Os resultados referentes ao desafio viral encontram-se expressos na Tabela 7.
DISCUSSÃO
Os sintomas manifestados pelos sagüis foram semelhantes aos descritos na literatura, porém constatou-se também, hipotermia, vômitos e fotofobia. No presente estudo, os sagüis desenvolveram a forma clínica paralítica; entretanto, este resultado não anula a possibilidade desta espécie animal apresentar em vida livre a raiva furiosa, considerando que os animais foram inoculados com vírus fixo. Nos experimentos de Perl e Good16, um macaco rhesus morreu 108 dias após ser infectado com vírus de rua e a duração da fase clínica foi de oito dias. A utilização do vírus CVS-31 neste experimento, permitiu abreviar o período de incubação, assim como a manifestação dos sinais clínicos e o óbito dos animais experimentais, possibilitando desenvolver o trabalho em menor período.
Na necropsia dos sagüis acometidos de raiva, constatou-se a presença de gases intestinais, fezes endurecidas na porção distal do intestino e bexiga também repleta de urina, provavelmente devido à paralisia dos esfíncteres vesical e anal, obtendo-se resultados compatíveis com trabalhos já descritos20. Microscopicamente, a encefalite rábica caracteriza-se por uma hiperemia meningoencefálica acompanhada de infiltração mononuclear, formada principalmente por linfócitos21 25. Estas conclusões se comparam aos resultados obtidos com os sagüis infectados.
Na natureza, o animal pode ser agredido em diferentes partes do corpo e serem inoculadas doses virais variadas. A distância do local de inoculação até o sistema nervoso central é também fator importante para o desenvolvimento da doença4. Este fato dificulta estipular a dose letal mínima capaz de causar raiva em um animal. Como não foram encontrados dados experimentais referentes à dose letal do vírus rábico para a espécie animal sob estudo, esta teve que ser previamente definida. Para camundongos, está estabelecida a DL5013, sendo esta utlilizada como procedimento de rotina nos desafios para os testes de verificação de potência de vacinas anti-rábicas de uma forma geral. Como foram usadas algumas destas vacinas e o vírus CVS, considerou-se adequado determinar a DL50 para sagüis da mesma forma como para camundongos.
A eficiência da vacina Fuenzalida e Palacios para carnívoros domésticos, tem sido comprovada experimentalmente6 22 e também na prática, no decorrer de anos de campanhas de vacinação anti-rábica. A vacina Fuenzalida e Palacios foi utilizada inicialmente nos sagüis mantidos em cativeiro como animais de estimação, que com freqüência são levados aos postos de vacinação por ocasião das campanhas anti-rábicas realizadas anualmente, promovidas por autoridades locais. A eleição desta vacina para a realização do trabalho baseou-se na necessidade de se constatar se ela é realmente eficaz ou apenas promove falsa idéia de proteção sem se ter um respaldo científico comprovado.
No experimento específico aqui descrito e analisado, ao se procurar averigüar a eficácia da vacina Fuenzalida e Palacios, se verificou que sagüis provavelmente respondem sorologicamente de maneira semelhante aos seres humanos, ou seja, uma única dose, ou mesmo com o reforço, não protegeram o animal mediante um desafio viral; porém, o esquema de vacinação adotado para pré-exposição em humanos, imunizou os animais em estudo. Por outro lado, os animais responderam mais satisfatoriamente quando imunizados com a vacina produzida em cultivo de células. Deste modo, avaliou-se que sagüis, caso sejam vacinados durante as campanhas anti-rábicas anuais para animais domésticos, não podem ser considerados protegidos. Apresenta-se então, a dificuldade da imunização de sagüis com este tipo de vacina, devido à necessidade de se administrar múltiplas doses, como no esquema empregado em seres humanos.
Os sagüis vacinados com uma dose única de vacina anti-rábica produzida em cultivo celular, mostraram-se imunes ao vírus da Raiva 45 dias pós-vacinação. A administração de vacina anti-rábica inativada e produzida em cultivo celular foi eficaz na indução de anticorpos anti-rábicos neutralizantes em primatas não humanos da espécie Macaca nemestrina15. Quando utilizada a mesma via de administração em sagüis, esta vacina levou a resultados semelhantes. Outros estudiosos também observaram a eficácia de tal vacina em outras espécies animais17 22 23. Em algumas delas, porém, havia necessidade do reforço para assegurar a imunização mais duradoura. O presente trabalho não verificou se a elevação de título à aplicação de um reforço foi representativa. Ressalta-se, no entanto, que apenas uma única dose foi considerada protetora durante o período estudado.
É importante enfatizar que os grupos de animais foram desafiados em datas diferentes, não sendo possível realizar um estudo comparativo entre as respostas vacinais. Além disso, este estudo não nos oferece base para afirmar sobre a imunidade desses animais por períodos mais longos (6 meses ou mais).
Mensurar os títulos de anticorpos neutralizantes é um parâmetro conveniente para avaliar a imunogenicidade das vacinas26. Entretanto, a titulação de anticorpos apenas não necessariamente comprova a imunidade de uma espécie animal contra uma determinada doença. A proteção real pode ser avaliada mais corretamente através do desafio viral.
A dificuldade da administração por via parenteral de animais silvestres, pode ser contornada, por meio de uma vacina oral. Entretanto, não foi possível testar vacinas anti-rábicas orais do tipo recombinantes nos sagüis, devido às restrições da legislação brasileira para o uso de organismos geneticamente modificados no meio ambiente, embora existam trabalhos realizados em primatas não humanos2 19 que indicam que esta opção poderia ser viável para Callithrix sp. Portanto, o uso de uma vacina oral para imunização de animais silvestres contra a doença, deve ser pesquisada mais a fundo, para a sua introdução, de forma segura, nas regiões onde a raiva ocorre endemicamente.
Os resultados obtidos nas condições do experimento permitiram chegar às seguintes conclusões: – a vacina Fuenzalida e Palacios foi ineficaz na imunização dos sagüis, utilizando o esquema adotado na campanha de vacinação anual destinada aos animais domésticos. Entretanto, o esquema de pré-exposição semelhante ao adotado para humanos, mostrou ser efetivo, embora este processo de imunização não apresente boa praticidade, em função do número de doses aplicadas; – a vacina produzida em células NIL-2 induziu boa imunidade e proteção nos sagüis vacinados com dose única; – os sintomas e as lesões apresentados pelos sagüis com raiva foram semelhantes aos observados em outros animais estudados, quando empregada amostra CVS; – os sagüis apresentam semelhança com a espécie humana no que se refere à sua resposta frente a uma imunização anti-rábica e, portanto, estes animais poderiam ser mais estudados como modelo animal para os testes de imunização anti-rábica humana.
AGRADECIMENTOS
Aos veterinários do Laboratório de Diagnóstico de Raiva do IMMVJV, pelo auxílio nos exames laboratoriais e à FIOCRUZ, pelo fornecimento de camundongos utilizados no Teste de Neutralização, bem como pelo fornecimento de alimentação aos animais do experimento.
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Laboratório de Biologia Animal – Empresa de Pesquisa Agropecuária do Estado do Rio de Janeiro, Niterói, RJ, Brasil.
Endereço para correspondência: Drª Márcia Cristina Ribeiro Andrade. Centro de Criação de Animais de Laboratório, Dept. de Primatologia/FIOCRUZ. Av. Brasil 4365, Manguinhos, 21045-900 Rio de Janeiro, RJ, Brasil. Tel: 55 21 598-4257/598-4389; Fax: 55 21 260-6707.
E-mail: andrade@bionet.biomang.fiocruz.br
Recebido para publicação em 13/1/99.
