Ana Raquel Mano MeinerzI; Patrícia da Silva NascenteII; Luiz Filipe Damé SchuchII; Marlete Brum CleffI; Rosema SantinII; Cristiane da Silva BrumII; Márcia de Oliveira NobreII; Mario Carlos Araújo MeirelesII; João Roberto de Braga MelloI
IPrograma de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Pelotas, RS IIPrograma de Pós-Graduação em Veterinária, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS
RESUMO
O estudo objetiva determinar a atividade in vitro da terbinafina e itraconazol através da técnica de microdiluição em caldo (NCCLSM27-A2) adaptado para um fungo dimórfico frente a 12 isolados de Sporothrix schenckii, sendo seis de esporotricose felina, três de esporotricose humana, um isolado de cão e dois isolados humanos provenientes do Instituto Oswaldo Cruz (IOC). O inóculo e as concentrações antifúngicas foram distribuídas em microplacas, as quais foram incubadas a 35°C por cinco dias, quando foi realizada a leitura da concentração inibitória mínima. A concentração inibitória mínima para a terbinafina variou de 0,055µg/ml a 0,109µg/ml e para o itraconazol de 0,219µg/ml a 1,75µg/ml, sendo que para ambos os fármacos as CIMs entre os isolados do IOC foi de 0,875µg/ml. O estudo demonstrou uma alta suscetibilidade do Sporothrix schenckii frente à terbinafina, necessitando mais estudos que correlacionem os testes in vitro frente ao fármaco com a resposta clínica em pacientes com esporotricose.
Palavras-chave: Sporothrix schenckii. Suscetibilidade. Terbinafina. Itraconazol.
ABSTRACT
The study objective was to determine the in vitro activity of terbinafine and itraconazole through the microdilution technique in broth (NCCLSM27-A2), adapted for dimorphic fungus, in relation to 12 isolates of Sporothrix schenckii. Six were from feline sporotrichosis, three from human sporotrichosis, one from a dog and two from human isolates originating from Instituto Oswaldo Cruz. The inoculum and antifungal concentrates were distributed on microplates that were incubated at 35°C for five days. Minimum inhibitory concentration readings were made at the end of this period. The MIC for terbinafine ranged from 0.055µg/ml to 0.109µg/ml, and the MIC for itraconazole ranged from 0.219µg/ml to 1.75µg/ml. For both drugs, the MIC from the isolates from IOC was 0.875µg/ml. The present study demonstrates the high susceptibility of Sporothrix schenckii to terbinafine. Further studies to correlate the in vitro susceptibility tests with the clinical response of patients with sporotrichosis are needed.
Key-words: Sporothrix schenckii. Susceptibility. Terbinafine. Itraconazole.
A esporotricose, micose subcutânea de evolução subaguda a crônica, causada pelo fungo dimórfico Sporothrix schenckii acomete o homem e várias espécies de animais. O felino doméstico representa importante papel na transmissão do agente a outros animais e para o homem, sendo que os relatos zoonóticos envolvendo essa espécie animal demonstra que o homem adquire a micose através de arranhadura, mordedura ou pela contaminação por solução de continuidade cutânea preexistente. A transmissão é facilitada devido a grande quantidade de células leveduriformes presentes nas lesões cutâneas dos felinos com esporotricose1 2 22.
O tratamento da esporotricose é realizado, freqüentemente, com itraconazol, sendo este considerado atualmente o fármaco de eleição para as formas cutâneas e linfocutâneas da micose em humanos9. Porém, devido ao seu uso indiscriminado, têm sido freqüentes os relatos de isolados resistentes ao fármaco, levando conseqüentemente a falhas terapêuticas e remissão da micose tanto nos homens como em animais19 21.
A terbinafina, antifúngico do grupo das alilaminas, demonstrou em vários estudos in vitro ação primária fungicida frente a fungos dimórficos, incluindo S. schenckii, não demonstrando problemas de resistência frente ao agente, além de efeitos tóxicos reduzidos quando comparado ao itraconazol3 5 7 9 10 14 17 20.
Considerando a esporotricose como uma micose zoonótica intensamente importante aos animais e homens, especialmente imunodeprimidos e a problemática em relação ao tratamento da micose, o estudo tem como objetivo avaliar a suscetibilidade de S. schenckii frente à terbinafina e itraconazol através da técnica de microdiluição em caldo descrita pelo documento NCCLSM27-A2, adaptada para um fungo dimórfico15.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados 12 isolados clínicos de Sporothrix schenckii, sendo seis casos de esporotricose felina, três de esporotricose humana, um proveniente de um caso da micose em cão e dois casos de esporotricose humana oriundas do Instituto Oswaldo Cruz (IOC 1824 e IOC 1226). Os isolados foram mantidos na sua fase miceliana e leveduriforme através de subculturas para tubos com meio Ágar Sabouraud dextrose com cloranfenicol acrescido de cicloheximida, sendo mantidas sob refrigeração em temperatura média de 4ºC.
Os isolados de S. schenckii foram estudados quanto à suscetibilidade frente ao itraconazol (Janssen Pharmaceutical) e terbinafina (Novartis Research Institute) através da técnica de microdiluição em caldo descrita no documento NCCLSM27-A2 adaptada para um fungo dimórfico15.
A partir da solução mãe dos fármacos terbinafina e itraconazol nas concentrações de 1.600µg/ml, foram realizadas nove diluições seriadas em DMSO alcançando uma concentração final dos antifúngicos de 3µg/ml. Essas concentrações foram diluídas a 1% cada, em meio RPMI 1.640 (GIBCO), estabelecendo concentrações com intervalos de 16µg/ml a 0,03µg/ml, as quais foram distribuídas em microplacas no sentido das colunas, em volume de 100µl15.
Os inóculos fúngicos, referentes aos isolados testados, foram preparados a partir de colônias jovens da fase leveduriforme de S. schenckii, as quais foram obtidas a partir do cultivo do agente em meio Brain Heart Infusion (BHI), sendo incubado a 37ºC sob agitação branda (40 ciclos/minutos), durante 10 dias. Após este período, as colônias foram filtradas em camada dupla de gaze estéril, centrifugadas (1.500rpm/15 minutos) e lavadas duas vezes com solução salina tamponada (PBS), sendo desprezado o sobrenadante16. As células leveduriformes foram ressuspensas com solução salina estéril, homogeneizadas, sendo o inoculo ajustado a turbidez do tubo 0,5 da escala de MacFarland. Essa suspensão fúngica foi diluída em solução salina estéril (diluição 1:50), homogeneizada em agitador e submetida a diluição em meio RPMI 1.640 (diluição 1:20), sendo então distribuída no sentido das fileiras nas microplacas15.
Os testes de suscetibilidade antifúngica foram realizados em duplicata, sendo uma coluna da microplaca para o controle positivo, preenchida com meio RPMI 1.640 e inóculo fúngico e outra coluna referente ao controle negativo, contendo o meio RPMI 1.64015.
As microplacas foram incubadas a 35ºC, por cinco dias, quando foi realizada a leitura da concentração inibitória mínima (CIM). A leitura da CIM foi visual, correspondendo à menor concentração do antifúngico em que não houve crescimento visível do S. schenckii quando comparado ao controle-positivo23.
RESULTADOS
A concentração inibitória mínima (CIM) para a terbinafina verificada entre todos os isolados estudados dos casos de esporotricose felina variaram de 0,055µg/ml a 0,109µg/ml, enquanto para os isolados provenientes de casos clínicos de esporotricose humana e canina resultaram em CIM de 0,055µg/ml e para os isolados IOC (1824 e 1226) foram de 0,875µg/ml (Tabela 1).
Em relação ao itraconazol, a CIM frente aos isolados de esporotricose felina foi de 0,875µg/ml a 1,75µg/ml, já para os casos de esporoticose humana os valores da CIM foram de 0,219µg/ml. Para o isolado do caso clínico de esporoticose canina foi observada uma CIM do itraconazol de 1,75µg/ml enquanto para os isolados provenientes do IOC (1824 e 1226) resultaram em valores de CIMs de 0,875µg/ml (Tabela 1).
DISCUSSÃO
Mesmo não existindo um ponto de corte que estabeleça quais os valores da que determinam a sensibilidade ou resistência do S. schenckii frente a terbinafina, estudos consideram que valores de CIM entre 0,1 a 0,4µg/ml estão associados à sensibilidade do agente frente ao fármaco. Os resultados observados no estudo demonstram uma intensa atividade in vitro da terbinafina frente aos isolados de campo de S. schenckii com valores de CIM mais baixos em relação ao itraconazol. Outros autores observaram resultados semelhantes, obtendo uma CIM menor ou igual aos antifúngicos recomendados para o tratamento da esporotricose, demonstrando ainda, uma atividade fungicida inicial da terbinafina frente ao agente7 8 12 17 18.
Assim, como para a terbinafina, também não há padronização de um valor da CIM para o itraconazol, que identifique resistência ou sensibilidade ao S. schenckii. No entanto, é preconizado que a suscetibilidade do agente frente ao fármaco traduz em CIM menor ou igual a 1µg/ml13 18. Considerando esses valores de CIM para o itraconazol, frente ao agente, o estudo observou sensibilidade em três isolados de esporotricose felina e em todos os isolados humanos avaliados, assim como para as cepas do IOC. Contudo, foi verificada resistência frente ao isolado de cão e para os demais isolados provenientes de esporotricose felina. Outros estudos confirmaram a boa atividade in vitro do fármaco frente ao S. schenckii, sendo considerado o tratamento de eleição para as formas cutânea e cutânea-linfática da micose em humanos4 10 11. Porém, têm sido demonstrados casos de resistência in vitro ao fármaco, resultando em CIMs de 4µg/ml para isolados de felinos com a forma sistêmica da micose12.
No estudo, foi observada grande amplitude de valores da CIM tanto para a terbinafina como para o itraconazol frente ao S. schenckii, coincidindo com outros estudos que determinaram à suscetibilidade do agente frente a esses antifúngicos. É importante considerar que não existe padronização para as técnicas de antifungigrama frente aos fungos dimórficos, sendo que a dificuldade de avaliar testes de suscetibilidade para essa classe de fungos está na padronização do inóculo, quando utilizado a sua fase filamentosa ou ainda no lento crescimento do microrganismo no caso de utilizar a sua fase leveduriforme6 11 12 13 18.
As análises realizadas no presente estudo permitem concluir que os isolados de campo do Sporothrix schenckii demonstraram intensa suscetibilidade in vitro frente à terbinafina, o que impulsiona mais investigações, inclusive estudos in vivo, que confirmem a potencialidade terapêutica da terbinafina frente ao agente. O estudo também ressalta a necessidade da padronização dos testes de suscetibilidade para os fungos dimórficos.
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Dra. Ana Raquel Mano Meinerz
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Recebido para publicação em 31/7/2006
Aceito em 18/1/2007
