Bruna Pedroso Tamegão-LopesI; Priscila Rocha RezendeI; Luciana Maria Cunha Maradei-PereiraI; José Alexandre Rodrigues de LemosI, II
IDivisão de Biologia Celular e Molecular da Fundação HEMOPA, Belém, PA, Brasil IIDepartamento de Genética da Universidade Federal do Pará, Belém, PA, Brasil
RESUMO
Os vírus linfotrópicos de células T humanas, quando integrados ao genoma da célula hospedeira, provírus, têm como marcador de replicação seu DNA proviral. A carga proviral parece ser um importante fator no desenvolvimento de patologias associadas a estes retrovírus. Neste estudo foi desenvolvida uma metodologia para quantificação absoluta da carga proviral dos HTLV-1 e HTLV-2 através da PCR em tempo real. Cinqüenta e três amostras de doadores de sangue com teste de ELISA reagente foram submetidas à metodologia, que utilizou o sistema TaqMan® para três seqüências alvo: HTLV-1, HTLV-2 e albumina. A quantificação proviral absoluta foi determinada através da proporção relativa entre o genoma do HTLV e o genoma da célula hospedeira, levando em consideração o número de leucócitos. O método apresentado é sensível (215 cópias/mL), prático e simples para quantificação proviral, além de eficiente e adequado para confirmação e discriminação da infecção pelos tipos virais.
Palavras-chaves: HTLV. PCR quantitativa em tempo real. Carga proviral do HTLV.
ABSTRACT
When the human T cell lymphotropic virus (HTLV) is integrated with the host cell genome (provirus), its proviral DNA is a replication marker. Proviral load appears to be an important factor in the development of diseases related to these retroviruses. In this study, a methodology for absolute quantification of the HTLV-1 and HTLV-2 proviral load using real-time PCR was developed. Fifty-three blood donor samples with positive ELISA test result were subjected to this methodology, which utilized the TaqMan® system for three target sequences: HTLV-1, HTLV-2 and albumin. The absolute proviral load was quantified using the relative ratio between the HTLV genome and the host cell genome, taking into consideration the white blood cell count. The method presented is sensitive (215 copies/ml), practical and simple for proviral quantification, and is efficient and appropriate for confirming and discriminating infections according to viral type.
Key-words: HTLV. Quantitative real-time PCR. HTLV proviral load.
Os vírus linfotrópicos de células T humanas (HTLV-1 e HTLV-2) integram a família Retroviridae, subfamília Oncovirinae, gênero Deltaretrovirus. Estes retrovírus têm sido classificados na famíliaRetroviridae, baseados em seqüências genéticas e homologias estruturais5, caracterizando-se por serem os únicos vírus diplóides de polaridade positiva2. Estes vírus infectam linfócitos, sendo o HTLV-1 com preferência por células CD4+ e o HTLV-2 por células CD8+, ambos com a capacidade de se integrar no genoma da célula hospedeira passando a se chamar de provírus.
São transmitidos verticalmente19 28 e horizontalmente, através de contato sexual, transfusão sanguínea e/ou uso de drogas intravenosas1 7 15 22. A transmissão hematogênica tem sido considerada relevante na disseminação do HTLV-1 e do HTLV-2 em áreas urbanas, entre UDI (usuários de drogas injetáveis) e doadores de sangue7 30. Entretanto, estima-se que a transmissão viral por transfusão ocorra em baixos, mas significativos níveis3 29.
As principais patologias associadas à infecção pelo HTLV-1 são: paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao HTLV-1 (PET/MAH)9 26 34; linfoma/leucemia de células T do adulto (LLcTA)16 32; uveíte associada ao HTLV-1 (HU)23; além de outras manifestações como dermatite infecciosa27. No Brasil, todas as patologias relacionadas à infecção pelo HTLV-1 já foram descritas em indivíduos infectados.
Em Hemocentros e Serviços de Hemoterapia, a implantação de testes de triagem sorológica para HTLV-1 e para HTLV-2 fez-se em cumprimento à portaria do Ministério da Saúde, de número 1376, de 19 de novembro de 1993. De maneira que se tornou possível identificar doadores infectados que necessitavam de orientação e acompanhamento, além de impedir que estes agentes virais fossem transmitidos através de transfusão em procedimentos hemoterápicos que empregam componentes celulares.
O diagnóstico sorológico da infecção pelos HTLV é baseado na presença de anticorpos, anti-HTLV, no soro do indivíduo. Entretanto, esta técnica é limitada na verificação da infecção em alguns aspectos, como por exemplo, quando o indivíduo infectado encontra-se no período de janela imunológica da infecção ou, está infectado por variantes imunológicas que não estão incluídas no teste de sorologia4 15 20.
Holland cols14 foram os primeiros a demonstrar que a clivagem de uma sonda duplamente marcada, pela atividade 5′ exonuclease da Taq DNA polimerase, poderia ser utilizada para detectar produtos específicos em uma reação de PCR10 33. Cada sonda é composta de duas moléculas: na extremidade 5′ a molécula reporter dye, FAM (6- carboxifluoresceína) e na extremidade 3′ a molécula quencher dye, TAMRA (6- carboxitetrametilrodamina).
É a partir da molécula reporter dye que se observa à emissão de fluorescência durante a fase de amplificação da PCR. A molécula quencher dye modula através do princípio de transferência de energia ressonante (FRET), a energia inerente à sonda intacta. Durante cada ciclo da PCR, uma molécula reporter dye é clivada para cada seqüência alvo amplificada, sendo esta fluorescência lida em tempo real6 14.
Nos ciclos iniciais da PCR há pouca mudança na emissão do sinal fluorescente. Isto define a linha base (baseline) do gráfico de amplificação. Qualquer aumento na emissão de fluorescência capaz de ultrapassar a baseline indica a detecção de acúmulos de produtos da PCR. Este parâmetro ou Ct (cycle threshold) é tido como o número fracionado de ciclos os quais acúmulos de fluorescência ultrapassam o limite fixado12.
A detecção da carga proviral através da PCR em tempo real é considerada relevante no monitoramento do número de células sangüíneas periféricas infectadas e na avaliação da propensão a patologias associadas ao HTLV-1. Alta carga proviral de HTLV-1 em células sangüíneas periféricas tem sido associada com alto risco para doenças neurológicas24. No caso do HTLV-2, um número significativo de linfócitos infectados pode contribuir para acelerar a imunodeficiência e aumentar o risco de neuropatia em indivíduos co-infectados com HIV-118.
A carga proviral pode servir de ferramenta para monitoramento biológico da eficácia de quimioterápicos e/ou anti-retrovirais, no caso de pacientes em tratamento da LLcTA6 18, sendo possível à integração deste método no protocolo de manejo clínico de pacientes infectados por estes vírus8 32. A análise da carga proviral associada a outros fatores, pode atuar como um indicador na predisposição a doenças associadas aos HTLV8 18 21. Em portadores assintomáticos, como doadores de sangue, a carga proviral pode ser um bom indicador de curso da infecção nestes indivíduos.
Este estudo tem como proposta a padronização do método da PCR quantitativa em tempo real para quantificação absoluta da carga proviral do HTLV-1 e do HTLV-2, bem como confirmar e discriminar a infecção por ambos os tipos virais em doadores de sangue com sorologia reagente para HTLV.
MATERIAL E MÉTODOS
Amostras. Foram analisadas cinqüenta e três amostras (n=53) de doadores de sangue da Fundação HEMOPA, na cidade de Belém do Pará, considerados inaptos para o processo de doação, porquanto na etapa de triagem sorológica terem tido resultado reagente no teste de ELISA para HTLV. As amostras de sangue foram coletadas em tubos de 5ml, contendo EDTA (anticoagulante etil-enediaminetetra-ácido-acético). Todas as amostras foram submetidas à contagem eletrônica de leucócitos, antes da etapa de extração de DNA genômico.
Triagem sorológica. A triagem sorológica utilizou teste ELISA seqüencial, contendo antígenos selecionados que detectam anticorpos IgA, IgM e IgD anti-HTLV (MUREX HTLV-I/II – Abbott Divisão de Diagnóstico). O teste ELISA foi realizado em duplicata e foram consideradas amostras sorologicamente reagentes, aquelas que exibiram valores de densidade óptica 20% maior que o valor de cut-off da placa.
Extração de DNA. A extração de DNA genômico foi realizada utilizando o kit de purificação de DNA genômico GFX (Amersham Pharmacia Biotech), a partir de leucócitos do sangue periférico, de acordo com instruções do fabricante.
PCR em tempo real. A PCR em tempo real utilizou o sistema TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA) de três seqüências alvo: o gene da albumina, como controle endógeno e as regiões não homólogas do gene pol do HTLV-1 e do HTLV-2. Primers e sondas foram desenhados e sintetizados pelo serviço Assay-by-DesignSM (Part Number 4331348) a partir de seqüências de interesse enviadas à Applied Biosystems. As seqüências de primers e sondas utilizadas na técnica da PCR em tempo real estão descritas nas tabelas 1 e 2.
As reações da PCR foram preparadas utilizando o conjunto de reagentes TaqMan® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), contendo nucleotídeos, tampão, UNG, AmpliTaq®, referência passiva (ROX), de acordo com instruções do fabricante. O protocolo de reação utilizou 15µL de Master Mix, 10,5µL de água, 1,5µL de Assay-by-Design (conjunto de primer e sonda), 3µL de DNA, sendo 30µL o volume final.
Foi utilizada a plataforma ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA), com o seguinte protocolo de ciclagem: um ciclo de 50ºC durante 2 minutos; um ciclo de 95ºC durante 10 minutos; 50 ciclos de 90ºC durante 50 segundos e 60ºC durante 1 minuto.
Quantificação proviral absoluta. Para realização da quantificação absoluta, inicialmente, foi realizada uma quantificação relativa, baseada em uma proporção que derivou da relação quantitativa entre alvo e o controle endógeno: Proporção do HTLV-1 ou HTLV-2 integrado no Genoma (PHG):
A equação final proposta para quantificação da carga proviral absoluta do HTLV-1 ou HTLV-2, considerou a contagem de leucócitos por mm3 da seguinte forma:
O número “2” representa o par de cromossomos do genoma celular ao qual o HTLV-1 ou o HTLV-2 pode se integrar. Os valores de carga proviral foram expressos em número de cópias de DNA do HTLV-1 ou HTLV-2 integrados no genoma do hospedeiro por mm3 de sangue.
RESULTADOS
A técnica da PCR em tempo real foi realizada em cinqüenta e três amostras (n=53) de DNA proviral extraído de leucócitos de sangue periférico, consideradas reagentes no teste de triagem sorológica, com o objetivo de confirmar, discriminar e quantificar a infecção, nestes indivíduos. Neste estudo, todos os portadores de infecção por HTLV eram assintomáticos.
A média de idade dos doadores inaptos foi de 40,5 anos (DP±12,9), sendo que dentre estes 18 (34%) pertenciam ao sexo feminino e 35 (66%) ao sexo masculino. A contagem de leucócitos exibiu uma média de 6643 (DP±2067) células por mm3.
Todas as amostras submetidas à técnica da PCR tiveram o controle endógeno amplificado (n=53). O HTLV-1 foi detectado em 35 (66%) amostras e o HTLV-2 em 18 (34%) amostras, confirmando a infecção nestes indivíduos (tabela 3).
A quantificação proviral absoluta foi realizada, de acordo com a metodologia descrita, em todas as amostras deste estudo, exibindo uma média de carga proviral de 226 cópias de DNA proviral/mm3(DP±423), variando entre 0,02 e 1503 cópias/mm3. Para análise da sensibilidade da PCR, na detecção dos HTLV, foram realizados três ensaios com amostras, em diferentes dias e placas. A flutuação de resultados, ora positivos, ora negativos na mesma amostra, nos três ensaios, foi interpretada como o limiar de sensibilidade que foi definido em 0,215 cópias de DNA por mm3 ou µL (DP±0,209) ou 215 cópias de DNA por mL (DP±209).
Além disto, para validar o método foi realizado um segundo ensaio com amostras em duplicata, cujo resultado foi avaliado pelo teste t de Student, resultando em p=0,269; o que mostra que o método é reprodutível e não se faz necessária à realização de réplicas durante procedimento de rotina.
DISCUSSÃO
A técnica da PCR vem sendo utilizada em diversos estudos de quantificação de carga proviral dos HTLV em células mononucleares de sangue periférico, tanto em indivíduos com manifestações clínicas associadas a este retrovírus, como em portadores assintomáticos25, os quais têm sido alvo destes estudos13 17 21.
A técnica da PCR em tempo real agrega algumas vantagens, dentre as quais: a utilização de sondas específicas, que atuam como sinalizadores moleculares, o que torna o ensaio altamente específico10; reação em um só passo, o que elimina o processo pós-PCR que diminui fontes de contaminações e erros6 10; além do que, os valores de CT, gerados a partir do aumento do sinal fluorescente associado aos produtos de PCR, são mais sensíveis do que os valores end-point, pois as medidas são feitas durante a fase exponencial, onde os componentes da reação não são limitados11.
Em nosso estudo, semelhante ao desenvolvido por Dehée cols6, a metodologia utilizada na PCR em tempo real amplifica as regiões não-homólogas do gene pol do HTLV-1 e do HTLV-2, atuando como alvos. Como controle endógeno, foi utilizado o gene celular da albumina. A amplificação do gene da albumina tem um importante papel como controle endógeno, permitindo uma quantificação proporcional. Tal gene é altamente conservado e atua de forma a normalizar variações causadas por diferenças na contagem de leucócitos, na extração de DNA e na presença de inibidores da PCR6 18.
No estudo desenvolvido por Dehée cols6, células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram isoladas para quantificação da carga proviral do HTLV-1, em indivíduos portadores sintomáticos e assintomáticos. Para tanto, foram construídos plasmídeos, contendo uma porção do gene da albumina e outra porção do gene pol do HTLV-1, o que possibilitou a preparação de curvas padrão, feitas em diluições seriadas a partir da concentração estoque. Apesar de referida como uma curva padrão de fácil reprodução e preparação, a construção de plasmídeos torna a técnica inviável para rotina laboratorial.
Entretanto, nosso estudo demonstra que a extração de DNA proviral, a partir de leucócitos totais, assim como a contagem de leucócitos são suficientes para análise da carga proviral dos HTLV, em indivíduos infectados, tendo nosso grupo obtido resultados similares aos do autor acima referido6. Pode-se concluir, que a utilização da curva padrão é desnecessária, frente à presença do controle endógeno e da contagem de leucócitos para quantificação proviral absoluta.
De tal maneira, podemos afirmar que a técnica da PCR em tempo real, como proposta pelo nosso grupo, é uma ferramenta útil, simples, prática, sensível e reprodutível para quantificação da carga proviral do HTLV-1 e do HTLV-2, além de altamente específica e adequada, para detecção e discriminação da infecção por estes retrovírus.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos à Fundação HEMOPA pela iniciativa no desenvolvimento deste trabalho, em especial à Dra. Luciana Maradei-Pereira.
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Recebido para publicação em 29/8/2005
Aceito em 4/12/2006
