Juliane Gomes de Paula Amato, Valdir Sabbaga Amato e Vicente Amato Neto
Departamento de Doenças Infecciosas e Parasitárias do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP e Laboratório de Investigação Médica - Parasitologia do Hospital das Clínicas, da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, SP, Brasil.
Resumo Os microsporídios são implicados em várias manifestações clínicas em pacientes com AIDS; os quadros diarréicos são os mais comuns. O diagnóstico das microsporidioses dependia da microscopia eletrônica para exame de materiais obtidos por procedimentos invasivos. A técnica de coloração tricrômica modificada permite o diagnóstico sem necessidade deste procedimento, através da microscopia óptica. No presente estudo foi aplicado o método de coloração tricrômica em fezes de 62 pacientes com diarréia, infectados pelo HIV ou com AIDS. Das 62 amostras, identificou-se esporos de microsporídios em uma. O trabalho corrobora a presença destes protozoários em nosso meio, associada a quadros de diarréia crônica em pacientes com AIDS e grave comprometimento imunológico; constata que este método de coloração promove satisfatória visualização de esporos de microsporídios em fezes e aponta caminhos para novos estudos.
Palavras-chaves: Microsporídios. Coloração tricrômica modificada. AIDS.
Abstract The microsporidia have been involved in several clinical manifestations in patients with AIDS, of whom diarrhoea is the commonest. The diagnosis of microsporidiasis depended on invasive procedures and the identification of the organisms is made by electron microscopy. The modified trichrome staining method allows that the diagnosis be made without such procedures by using light microscopy. In the present work, the modified trchrome method was applied in stools from 62 patients with diarrhoea, who had asymptomatic HIV infection or AIDS. Of the 62 samples analyzed, there was detection of microsporidial spores in one. This work confirms the existence of such protozoans in our patients, associated with manifestations of chronic diarrhoea in patients with AIDS who have severe immunodeficiency and ascertains that this staining method allows satisfactory identification of microsporidia from faeces, as well points out some directions to further studies.
Key-words: Microsporidia. Modified trichrome staining. AIDS
As microsporidioses são infecções causadas por protozoários intracelulares obrigatórios, ubiqüitários, pertencentes ao filo Microspora, os quais são genericamente designados pelo termo não taxonômico de microsporídios3 4 9 16 19.
Antes da pandemia da AIDS, as infecções por estes protozoários eram extremamente raras, havendo na literatura apenas dez casos, suficientemente bem documentados, de microsporidiose não associada ao vírus da imunodeficiência humana1 6 10 15 21 22 23 30 33. Por outro lado, desde 1985 quando o primeiro caso de microsporidiose em paciente com AIDS foi descrito na França por Modigliane et al24, um crescente número de casos relacionados a esta condição de comprometimento imunológico vem sendo descrito em várias regiões do mundo, envolvendo um espectro cada vez mais abrangente de manifestações clínicas, sendo os quadros diarréicos os mais comuns.
O método de coloração tricrômica modificado por Weber et al38 constitui significativo avanço, pois possibilita a identificação dos esporos de microsporídios em materiais de fácil obtenção, como fezes e urina, através do emprego da microscopia óptica, viabilizando assim, a realização do diagnóstico em um maior número de pacientes sem necessidade de procedimentos invasivos26 32 35 38 42. O presente estudo tem por objetivo desenvolver experiência com a aplicação deste método diagnóstico, o qual é perfeitamente viável e facilmente aplicável aos laboratórios de Parasitologia, e iniciar um melhor entendimento sobre estas infecções em nosso meio.
MATERIAL E MÉTODOS
Entre maio de 1995 e janeiro de 1998, foram arrolados 60 indivíduos adultos com infecção pelo HIV diagnosticada pelo método de ELISA e confirmada pela técnica de Western blot, os quais apresentavam ou acometimento assintomático pelo HIV ou AIDS, de acordo com os critérios estabelecidos pelos “Centers for Diseases Control and Prevention” (CDC)12, além de duas crianças filhas de mães com AIDS. Para inclusão no estudo deveria haver diarréia, definida como três ou mais episódios de fezes líquidas ou pastosas no período de 24 horas38. De cada indivíduo foi colhida uma amostra de material fecal disposta em dois frascos, um contendo formalina a 10% e outro sem conservante. As amostras foram analisadas no Laboratório de Investigação Médica-Parasitologia do HC-FMUSP, onde foram submetidas à pesquisa de protozoários e helmintos através dos métodos de Hoffmann et al18, Faust et al17 e Kinyoun20. A pesquisa de esporos de microsporídios foi efetuada segundo o método da coloração tricrômica modificado, desenvolvido por Weber et al38. Sempre que possível, foi obtida a contagem de linfócitos CD4, efetuada até no máximo um mês antes ou após a coleta do material fecal.
RESULTADOS
As características demográficas dos 62 indivíduos estão resumidas na Tabela 1. Destes, 16 apresentavam infecção assintomática pelo HIV (25,8%) e 46 tinham AIDS (74,2%). A média da contagem de linfócitos CD4 dos 60 que dispunham deste exame foi de 157,2 células/mm3. Os pacientes em sua maioria apresentavam diarréia líquida (79%), e o restante, fezes pastosas (21%). O tempo de duração da diarréia foi menor que sete dias em 12 (19,4%), de sete dias a um mês em 21 (33,9%), e acima de um mês em 29 (46,7%). Existiram sintomas associados ao quadro diarréico em 64,5%, os quais estão especificados na figura 1.
Dentre as 62 amostras de fezes, houve identificação de esporos de microsporídios em apenas uma. Estes esporos apresentavam as mesmas características relatadas por Weber et al38, ou seja, estruturas ovóides de aproximadamente 1,5 x 0,9µm, coradas em vermelho rosado brilhante, com distinta faixa disposta equatorial ou diagonalmente, deixando assim evidente uma extremidade descorada (figura 2). Outros achados do exame parasitológico estão expostos na Tabela 2.
DISCUSSÃO
O método de coloração tricrômica modificado por Weber et al38 representa um verdadeiro progresso para o diagnóstico das microsporidioses humanas, pois provê uma fácil detecção dos esporos em materiais de simples obtenção, como fezes e urina, sem ter que submeter o paciente a procedimentos invasivos, sendo considerado o método de coloração padrão para o diagnóstico destas parasitoses através da microscopia óptica26 32 35 38 42. A evidência de esporos de microsporídios em um dos 62 pacientes da presente amostra, constata a existência destes protozoários em nosso meio. O paciente em questão, era do sexo masculino, tinha 31 anos, diagnóstico de AIDS e apresentava diarréia por tempo superior a um mês, com fezes de consistência pastosa, sintomas associados de náuseas e dor abdominal, possuindo uma contagem de linfócitos CD4 de 35 células/mm3. Estas características estão de acordo com as referidas na literatura, a qual relata, na maioria das vezes, casos de microsporidiose intestinal em indivíduos com AIDS, gravemente imunodeficientes, apresentando contagem de linfócitos CD4 inferiores a 100 células/mm3, com diarréia de longa duração2 11 25 27 28 29 34 36 37 38 39 40 42 43.
Entretanto, igualmente é relatado na literatura a presença de microsporídios associada a quadros de diarréia em pessoas com infecção pelo HIV e menor grau de comprometimento imunológico2 13 41 42, pacientes com AIDS e diarréia de evolução autolimitada43, assim como em imunocompetente não infectado pelo HIV, com diarréia auto-limitada e apresentando contagem de linfócitos CD4 de 2 a 052 células/mm3 33; também é relatado paciente submetido a transplante de coração e pulmão, não infectado pelo HIV, com diarréia crônica e contagem de linfócitos CD4 superior a 300 células/mm3 30, além de haver publicação de um caso de diarréia em criança infectada pelo HIV40. Estes relatos serviram de base para a decisão de incluir no presente estudo pacientes com diarréia de mais curta duração, tivessem eles AIDS ou infecção assintomática, e também crianças, não somente indivíduos com AIDS que sofresses de diarréia crônica e grave deficiência imunológica.
Todavia, o encontro de esporos de microsporídios em apenas 1,6% da amostra poderia estar relacionado a pelo menos três fatores. O primeiro, referente à observação referida por alguns autores de que a excreção de esporos é aparentemente feita de maneira irregular à semelhança de outros parasitas intestinais e, sendo assim, poderia não ser detectada em uma única amostra de material fecal5 9 13. O outro diz respeito à relação, constatada recentemente por Clarridge et al13, entre a abundância de parasitas em material de biópsia intestinal, aliada à presença de esporos em amostras de fezes, sendo pois, a detecção de esporos em material fecal tanto mais fácil quanto maior a quantidade de esporos e estágios plasmodiais presente nos tecidos. Estes autores constataram esporos de microsporídios ao exame de espécimes fecais em 100% dos pacientes com moderada ou abundante quantidade de parasitas nos tecidos, ao passo que este número decrescia para 57% nos pacientes com pequena quantidade tecidual de parasitas; conseqüentemente, mesmo em um paciente infectado por microsporídios, a pesquisa de esporos nas fezes pode resultar negativa se o grau de parasitismo da mucosa intestinal for pequeno. O terceiro fator pode estar correlacionado ao tamanho da amostra estudada. Embora os casos começaram a ser incluídos em maio de 1995, eles foram mais efetivamente coletados de janeiro de 1996 a janeiro de 1998, período este que veio coincidir com importantes avanços na terapêutica para AIDS. Com o advento das associações de drogas antiretrovirais, observou-se uma sensível redução nos casos de infecções oportunistas, especialmente com relação aos casos de diarréia. Evidentemente este decréscimo prejudicou a ampliação da presente amostra.
Seria pertinente ressaltar que a maioria dos estudos que relatam casos de microsporidiose intestinal envolve populações altamente selecionadas, ou seja, pacientes com AIDS e pronunciada imunodeficiência, com diarréia crônica sem etiologia definida, a despeito da extensa e minuciosa investigação diagnóstica, ou grave síndrome mábsortiva2 7 8 14 24 25 27 28 29 31 39 41 44. Portanto, as prevalências extraídas destes trabalhos, que variam de 2 a 50%, não refletem a real freqüência da associação das microsporidioses com acometimentos intestinais, a qual, pois, para ser estabelecida dependerá de estudos com populações maiores e mais abrangentes.
Os outros achados ao exame parasitológico expressam agentes comuns envolvidos na etiologia de distúrbios intestinais na população em geral, como Giardia lamblia e ancilostomídeo, e propriamente nos pacientes com AIDS como, Isospora sp e Cryptosporidium sp, enquanto que protozoários considerados não patogênicos também foram identificados, como Endolimax nana e Iodamoeba bütschilii. Não foi objetivo deste trabalho estudar os agentes etiológicos das diarréias de pacientes com AIDS ou infecção assintomática pelo HIV, sendo a pesquisa de cistos, ovos e larvas apenas uma complementação do exame de fezes, e que serviu ao intuito de melhor assistir os pacientes do ponto de vista da investigação diagnóstica.
Muitas lacunas referentes ao estudo das microsporidioses humanas permanecem sem esclarecimento, especialmente em nosso meio. Dúvidas sobre se sua patogenicidade ocorre somente frente a situações de comprometimento imunológico ou se poderia ser responsável por muitos quadros autolimitados em indivíduos imunocompetentes; questões a respeito da existência de portadores sãos, bem como distribuição geográfica, reservatórios, modos de transmissão, possíveis tratamentos e controle de cura. Estes grandes hiatos somente começaram a ser preenchidos mediante o aumento da experiência por parte dos laboratórios com técnicas diagnósticas aplicáveis não somente aos grandes centros de pesquisa, mas igualmente aos laboratórios de rotina, com finalidade assistencial, como é o caso do método de coloração tricrômica modificado por Weber et al38. Entretanto, paralelamente será mais prudente proceder a um amplo estudo comparativo entre as diversas técnicas de coloração para microsporídios, que se vêm proliferando na literatura em anos recentes, inclusive contrapondo-as ao exame histopatológico pela microscopia óptica e eletrônica, para estabelecer a verdadeira sensibilidade e especificidade de cada uma. Todos os demais aspectos dos estudos das microsporidioses, como imunofisiopatogenia e terapêutica, estarão estritamente vinculados a estes esclarecimentos fundamentais.
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Endereço para correspondência: Dr.ª Juliane Gomes de Paula Amato. Alameda Gabriel Monteiro da Silva 429, 01441-000 São Paulo, SP, Brasil.
Fax: 55 11 881-8158.
Recebido para publicação em 17/4/98.
