Eloisa da Graça do Rosario GonçalvesI; Nilma Cintra LealII; Ernesto HoferIII
IDepartamento de Patologia da Universidade Federal do Maranhão, São Luis, MA IICentro de Pesquisa Ageu Magalhães da Fundação Instituto Oswaldo Cruz, Recife, PE IIILaboratório de Zoonoses Bacterianas da Fundação Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ
RESUMO
O estudo foi desenvolvido com o objetivo de analisar o perfil plasmidial, pesquisar genes de virulência e identificar os perfis genéticos de 31 cepas de Vibrio cholerae não O1 isoladas de zooplâncton dos estuários dos rios Anil e Bacanga em São Luis MA. O estudo do DNA plasmidial revelou a presença de 2 a 3 plasmídeos em 10 cepas, com pesos moleculares variando de 5,5 a 40 kilobases. A ribotipagem revelou um perfil comum a todas as cepas. A amplificação do DNA genômico por PCR não revelou os genes ctxA, ace e zot, mostrando tratar-se de cepas não patogênicas, enquanto a RAPD-PCR identificou múltiplos perfis genéticos, achado compatível com o grande potencial de variabilidade desta espécie.
Palavras-chaves: Vibrio cholerae não O1. Baía de São Marcos. Ecologia. Estudo molecular.
ABSTRACT
The study was developed to analyze the plasmidial DNA, research virulence genes and identify genetic diversity of 31 strains of Vibrio cholerae non-O1 isolated from zooplankton of the Bacanga and Anil rivers in São Luis-MA. The study of plasmidial DNA showed 2 or 3 plasmids from 10 strains between 5.5 and 40 kilobasis. There was only single ribotype pattern. PCR methods did not show the genes ctxA, ace and zot, while RADP-PCR identified genetic diversity in the strains, showing the potential for variability in this species.
Key-words: Vibrio cholerae non-O1. São Marcos bay. Ecology. Molecular study.
A espécie Vibrio cholerae, integrante natural da flora bacteriana de ambientes aquáticos9 está classificada em 140 sorogrupos, com base nas características do antígeno somático “O”23. Conversões sorológicas foram demonstradas entre os sorogrupos em condições controladas no laboratório, com perda da aglutinabilidade de V. cholerae O1 e aquisição dessa característica por vibrios não-O13 6 20.
Poucos estudos sobre a ecologia desta bactéria foram desenvolvidos em condições naturais. Inicialmente, a demonstração dos sorogrupos não-O1 no meio ambiente não costumava despertar a atenção como um potencial problema de saúde pública com a identificação do sorogrupo O139 na etiologia de doença diarréica idêntica à cólera clássica, em 1992, nos países banhados pela Baía de Bengala, desfez-se a convicção de que só o sorogrupo O1 seria capaz de produzir cólera epidêmica1. Estudos moleculares recentes têm demonstrado o grande potencial de variabilidade genética e a dinâmica de transferência horizontal de genes de virulência entre os diferentes sorogrupos, reforçando o potencial de patogenicidade desta espécie7 12.
O município de São Luis está situado às margens da Baía de São Marcos, onde deságuam os rios Anil e Bacanga, cujas nascentes encontram-se no interior da Ilha de São Luis. As populações ribeirinhas dos dois estuários mantêm-se em estreito contacto com o ambiente aquático em atividades de pesca e de lazer, expostas ao risco de infecção. O presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de analisar o perfil genético, assim como pesquisar a existência de genes de virulência em cepas de Vibrio cholerae isoladas em amostras de zooplâncton coletadas no referido ambiente.
MATERIAL E MÉTODOS
Amostras de zooplancton foram coletadas de Outubro de 1997 a Outubro de 1998, em intervalos mensais, elegendo-se duas estações fixas de amostragem (1 e 2), nos estuários dos rios Anil e Bacanga, os quais deságuam na Baía de São Marcos, São Luis – MA. Foi empregada no processo, rede de plâncton, confeccionada em malha de 65mm de abertura, em arrastos horizontais, subsuperficiais, por 5 minutos, cobrindo raio de cinco metros. Amostras de 400ml de água, contendo zooplâncton, foram mantidas em frasco estéril e à temperatura ambiente, sendo submetidas em, no máximo duas horas, ao processo clássico de isolamento bacteriano8.
Para o estudo do DNA plasmidial das cepas isoladas foi empregada a técnica de extração do DNA por lise alcalina, sem adição de lisozima4. O material obtido foi submetido à eletroforese em Gel de Agarose 0,6% em tampão TBE (Tris-borato 0,089M; ácido bórico 0,098M; EDTA 0,002M). A migração deu-se em temperatura ambiente, empregando-se corrente constante de 20mA e 100V, por duas horas. O DNA foi corado com brometo de etídio (15mg/ml) e observado em transiluminador de luz ultravioleta (UV). O peso molecular dos plasmídeos foi estimado pela comparação com plasmídeos previamente conhecidos, presentes na cepa controle, Escherichia coli39R861.
Para a detecção dos genes de virulência – ctxA (enterotoxina da cólera), ace (enterotoxina acessória da cólera) e zot (toxina da zona ocludens) – o DNA total foi extraído pela técnica descrita por Maniatis e col15, sendo empregada PCR em sua amplificação, com os seguintes iniciadores:
Para o gene ctxA: 5′ CTC AGA CGG GAT TTG TTA GGC ACG 3′ e 5′ TCT ATC TCT GTA GCC CCT ATT ACG 3′, descritos por Keasler e Hall13.
Para o gene ace : 5′ AGA GCG CTG CAT TTA TCC TTA TTG 3′ e 5′ AAC TCG GTC TCG GCC TCT CGT ATC 3′.
Para o gene zot: 5′ GCT ATC GAT ATG CTG TCT CCT CAA 3′ e 5′ AAA GCC GAC CAA TAC AAA AAC CAA 3′.
Os dois últimos pares de iniciadores foram construídos a partir de seqüências disponíveis no GenBank, cuja senha de acesso é AF 175708, utilizando-se o programa DNAstar. As reações foram preparadas em volume final de 25ml por tubo, contendo 20ng de DNA molde; Tris-HCL 10mM; KCL 50mM; MgCl2 1,5 mM; 2 ml de dNTP 200mM de cada nucleotídeo (Pharmacia); 20pmol de cada “primer” e 1 U de Taq DNA polimerase (Pharmacia). Em cada partida de amplificação foi incluído um controle positivo (DNA da cepa de referência V. cholerae O1 569B, Clássico/Inaba) e um controle negativo (todos os componentes da mistura de reação, exceto o DNA). As amplificações foram feitas em termociclador Perkin Elmer, programado para 30 ciclos de 1 minuto a 92ºC para a desnaturação do DNA, 1 minuto a 55ºC para anelamento dos iniciadores e 2 minutos a 72ºC, para o alongamento ou síntese de DNA, terminando por uma etapa de 7 minutos a 72ºC para alongamento final das fitas.
Dez microlitros dos produtos das amplificações foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1%, no tampão TBE, a 100V e 200mA. O gel foi corado com Brometo de etídio, sendo o DNA visualizado em transiluminador de luz ultravioleta (UV) e fotografado em Polaroide.
O perfil genético das cepas foi estudado através de RAPD-PCR, empregando-se os iniciadores 784(5’GCG GAA ATA G 3′) e 791 (5′ GAG GAC AAA G 3′). As reações foram desenvolvidas em volume final de 25ml por tubo, contendo 20ng de DNA molde; 2,5ml do tampão de raeção 10x concentrado (tris-HCl 100mM; KCl 500mM; MgCl2 3,0mM; 2,5ml de dNTP 200mM (Pharmacia). Foi utilizado termociclador (Perkin Elmer) programado para 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 36ºC e 2 minutos a 72ºC. Finalmente, 10 microlitros dos produtos das amplificações foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1%, nas condições anteriormente descritas.
A técnica de ribotipagem por PCR, descrita por Kostman e cols14, foi empregada, utilizando-se os iniciadores 1 (5’TTT CTG CAG YGG NTG GAT CAC CTC CTT 3′) e 2 (5′ ACG AAT TCT GAC TGC CMR GGC ATC CA 3′), desenhados por Chun e col5.
RESULTADOS
Foram obtidos 55 isolados de V. cholerae não O1, 48 (87,3%) provenientes do Rio Bacanga e 7 (12,7%), do Rio Anil, dos quais 31 foram submetidos ao estudo molecular. Estes isolados são provenientes das amostras coletadas entre os meses de dezembro de 1997 e abril de 1998, estando a distribuição temporal e espacial representada na Tabela 1. Um isolado de V. alginolyticus, três de V. parahaemolyticus e 1 de Vibrio sp foram incluídos no estudo a título experimental e para confronto com o perfil de V. cholerae.
Dos 31 isolados, 10 (32,2%) exibiram de 2 a 3 plasmídeos, com pesos moleculares variando entre 5,5 e 40 kilobases (Figura 1).
Não foram detectados os genes de toxigenicidade ctxA, zot ou ace em nenhum dos 31 isolados, pela técnica de PCR.
Nas Figuras 2 e 3 estão representados os produtos da RAPD-PCR. Com o emprego do iniciador 791 foram identificados 13 perfis genéticos diferentes, com amplificação de 2 a 9 bandas entre 600 e 2000 pares de bases, enquanto 7 grupos genotípicos foram demonstrados com o iniciador 784, havendo amplificação de 2 a 4 bandas, variando entre 150 a mais de 2000 pares de bases.
A ribotipagem por PCR mostrou padrão de amplificação idêntico nos 31 isolados não O1, conforme gel representativo mostrado na Figura 4.
DISCUSSÃO
O emprego de técnicas moleculares no estudo da espécie Vibrio cholerae, tem tornado possível um melhor entendimento do potencial de variabilidade genética, de virulência e da dinâmica de transferência horizontal de genes entre diferentes sorogrupos. A presença do cassete VCR, envolvido na expressão do gen sto (toxina termo-estável) foi demonstrada em sorogrupos diversos de V. cholerae, assim como em outras espécies de Vibrio16. Mais recentemente, foi identificada por Karaolis et al12 a Ilha de Patogenicidade do V. cholerae (VPI), onde se situa o operon que codifica o pili co-regulado com a toxina, em cepas toxigênicas de V. cholerae não O112. Em estudo de 41 isolados de V. cholerae não O1, provenientes das regiões Norte e Nordeste do Brasil, foram detectadas seqüências compatíveis com os genes toxT e tcpA em uma proporção das cepas17. Estes dados, aliados à emergência do sorogrupo O139 como patógeno capaz de produzir doença diarréica semelhante à cólera clássica, reforçam a importância que a espécie Vibrio choleraeassume no campo da patologia humana.
A presença de plasmídeos em 10 cepas é comparável ao achado de outros pesquisadores que os demonstraram em sorogrupos não O1 de Vibrio cholerae2 17 18. A função exercida por estas estruturas não está bem definida em V. cholerae, sendo considerados crípticos, uma vez que a retirada deles por passagens sucessivas in vitro não alterou as características de virulência das cepas bacterianas18. Padrão similar de atividade hemaglutinante, citotóxica e enterotóxica foi constatado entre cepas de V. cholerae, portadoras ou não de plasmídeos numa evidência de que essas características nem sempre são mediadas por eles2. Contudo, em algumas cepas foram detectados plasmídeos que abrigavam genes de resistência a múltiplos antibióticos, transferíveis a outros grupos bacterianos.
A ausência dos genes ctxA, ace e zot pela técnica de PCR são comparáveis aos resultados encontrados em estudo de cepas ambientais de V. cholerae O1 e não O1 isoladas antes e durante epidemia de cólera no estado de São Paulo, o qual demonstrou que os isolados de V. cholerae O1 relacionados à epidemia continham os genes ctxA e zot, enquanto os pré-epidêmicos e todos os não O1 eram negativos21 . No entanto, apesar de não ser comum o encontro de cepas produtoras da toxina termolábil, característica da cólera, em cepas ambientais de V. cholerae não O1, a produção de citotoxinas e enterotoxinas semelhantes à toxina colérica foi demonstrada em ensaios laboratoriais, demonstrando o potencial de patogenicidade contido nessas cepas11 19 22 25.
A ribotipagem revelou apenas um perfil, evidenciando a circulação de um único ribotipo no ambiente estudado. No entanto, a identificação de múltiplos perfis genéticos entre os 31 isolados submetidos à RAPD-PCR corrobora as observações de outros autores quanto ao grande potencial de variabilidade apresentada pela espécie V. cholerae10 12 24. Levando-se em conta a distribuição dos isolados nas 4 estações de amostragem, constata-se que as cepas são, em geral, provenientes do mesmo estuário, ainda que de estações diferentes. No entanto, com o grupo formado com os isolados 17, 18 19 e 22, os quais apresentam o mesmo perfil com o iniciador 791 a procedência foi diversificada, tendo sido o isolado 17 obtido de amostra coletada na estação 1 do rio Bacanga, enquanto os outros 3 são provenientes da estação 2 do rio Anil. Com o iniciador 784, com o qual foram definidos 7 perfis distintos, os agrupamentos são formados por maior número de isolados, observando-se que, em relação à distribuição espacial, repete-se o padrão descrito com o iniciador 791. Observou-se, ainda, em relação aos meses de coleta que alguns isolados com perfil idêntico foram obtidos a partir de amostras coletadas em meses diferentes, como no caso dos isolados 13, 14 (fevereiro/98), 15 e 16 (março/98). Estas observações sugerem um comportamento dinâmico da espécie, condicionado, provavelmente, pelas variações das condições ambientais, as quais poderiam selecionar a predominância de determinado genótipo em épocas e locais diferentes.
AGRADECIMENTOS
À equipe do Departamento de Microbiologia, do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/FIOCRUZ, Recife-PE, pelo apoio técnico no processamento das amostras
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Endereço para correspondência
Dra. Eloisa da Graça do Rosario Gonçalves
Depto de Patologia/UFMA
Praça Madre Deus 2, Térreo, Bairro Madre Deus
65025-560 São Luis, MA
Telefone: 55 98 221-0270
e-mail: regionalsbmt@elo.com.br
Recebido para publicação em 16/10/2003
Aceito em 19/05/2004
Apoio finaceiro: CAPES
