Fábio Freire José1, Indiara Maria da Silva1, Maria Ilma Araújo1,2, Roque P. Almeida2, Olívia Bacellar2 e Edgar M. Carvalho1,2
1. Escola Baiana de Medicina e Saúde Pública; 2. Serviço de Imunologia, Hospital Universitário Professor Edgard Santos da Universidade Federal da Bahia, Salvador, Bahia, Brasil.
Resumo O teste de Montenegro, utilizado no diagnóstico da leishmaniose tegumentar, tem sido recentemente considerado marcador de imunogenicidade após vacinação. Neste estudo, avaliou-se o poder sensibilizante deste teste e a produção de y-IFN in vitro, em indivíduos não expostos a Leishmania. Utilizaram-se para o teste antígenos de L. amazonensis produzido em nosso laboratório (grupo I) ou produzido pela FIOCRUZ-RJ (grupo II). No dia 30, 33% dos indivíduos do grupo I e 42% do grupo II converteram o teste para positivo, comparando-se com 67% do grupo I e 50% do grupo II no dia 90. y-IFN foi detectado em 56% dos indivíduos do grupo I e 17% do grupo II no dia 30 (169±309 e 11±36pg/ml) e em 67% do grupo I e 58% do grupo II no dia 360 (69±107 e 18±20pg/ml). Estes dados demonstram que o teste de Montenegro induz, além de hipersensibilidade tardia, a produção de y-IFN.
Palavras-chaves: Teste de Montenegro. Teste cutâneo de hipersensibilidade tardia. Diagnóstico de leishmaniose.
Abstract The Montenegro skin test, used to diagnose cutaneous leishmaniasis, is now being considered to detect immunogenicity after vaccination. In this study, we evaluated the ability of this test to induce immune response and IFN-g production in subjects not previously exposed to Leishmania. The Montenegro skin test was performed using antigens of L. amazonensis produced by our laboratory (group I) or by FIOCRU-RJ (group II). At day 30, 33% of the subjects from group I and 42% from group II were positive, compared to 67% from group I and 50% from group II at day 90. IFN-y was detected in 56 % of subjects from group I and 17% from group II at day 30 (169±309 and 11±36pg/ml) and in 67% from group I and 58% from group II by day 360 (69±107 and 18±20pg/ml). These data demonstrate that the Montenegro skin test induces not only a delayed hypersensitivity reaction, but also IFN-y production.
Key-words: Montenegro skin test. Delayed hypersensitivity skin test. Leishmaniasis diagnosis.
A intradermorreação idealizada por Montenegro27 representa o principal exame complementar para o diagnóstico da leishmaniose tegumentar americana (LTA) em áreas endêmicas, sendo, portanto, de relevante importância para países como o Brasil, que, juntamente, com o Afeganistão, Peru, Arábia Saudita e Síria detêm 90% dos casos de leishmaniose tegumentar em todo o mundo41. Essa reação de hipersensibilidade tardia possui sensibilidade variando entre 86 e 100% e especificidade de aproximadamente 100%10 11, o que a consagrou como uma das provas mais usadas na confirmação da doença ativa, no diagnóstico retrospectivo e em inquéritos epidemiológicos de LTA9 13 30 31 33 36. Uma reação de Montenegro positiva em indivíduos de áreas endêmicas sem história de leishmaniose tegumentar americana e sem qualquer lesão suspeita, aponta para a possibilidade de formas abortivas ou infecções subclínicas11 12 20.
A despeito da alta sensibilidade e especificidade do teste de Montenegro, existem relatos de reação cruzada, principalmente em indivíduos com doença de Chagas e indivíduos curados de leishmaniose visceral35. Resultados falsos negativos também têm sido descritos quando a infecção é precoce8, ou em casos em que a doença cutânea seja causada por Leishmania amazonensis37. Apesar do teste de Montenegro ser plenamente aceito, diferenças na preparação comercial podem afetar a antigenicidade e a eficácia na detecção de diversas formas de leishmaniose em diferentes áreas geográficas1 2.
A negatividade do teste intradérmico de Montenegro tem sido utilizado como critério de inclusão de indivíduos em estudos que visam caracterizar a resposta imune e a eficácia da imunização após a utilização de vacinas contra leishmaniose4 5 22 23 24 28. A demonstração de que o teste de Montenegro pode sensibilizar o hospedeiro e fazer com que, em uma segunda oportunidade, a reação torne-se positiva, compromete a utilização do mesmo como indicador de proteção após vacinação29. Estudo in vitro avaliando a resposta linfoproliferativa de indivíduos vacinados para leishmaniose e indivíduos que se submeteram ao teste de Montenegro, porém não receberam a vacina, não mostrando diferenças significativas entre os grupos26.
Considerando-se a importância do teste de Montenegro na prática clínica e na pesquisa, o objetivo do presente estudo foi avaliar comparativamente o poder imunizante de duas diferentes preparações de antígenos utilizados no teste de Montenegro, analisando a resposta imune in vivo e in vitro para antígenos de Leishmania, incluindo a determinação da produção de gama-interferon (y–IFN), desde que esta citocina representa o principal fator estimulador de macrófagos para destruição de Leishmania6.
MATERIAL E MÉTODOS
Indivíduos estudados. Participaram do estudo 24 indivíduos sadios recrutados entre alunos do curso médico e profissionais da área de saúde, de ambos os sexos, com idades variando entre 18 e 30 anos, sem história prévia de leishmaniose, não residentes e não procedentes de áreas endêmicas da doença e que, durante o período do estudo, tivessem baixo risco de serem expostos à infecção por Leishmania. Os indivíduos negavam alergias, tinham sorologia negativa para HIV, e epidemiologia negativa para doença de Chagas. A participação no estudo teve caráter voluntário e os indivíduos assinaram um termo de consentimento. O projeto foi aprovado pelo comitê de ética médica do Hospital Universitário Professor Edgard Santos, UFBA, Salvador-Bahia.
Os indivíduos foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos de 12, a depender do antígeno usado para o teste de Montenegro. No grupo I, utilizou-se antígeno solúvel de promastigotas de L. amazonensis preparado em nosso laboratório, e no grupo II, antígeno particulado de promastigotas de L. amazonensis produzido industrialmente (gentilmente cedido por Dr. Mauro Marzochi). Foram excluídos três indivíduos do grupo I que por ocasião da primeira reação de Montenegro apresentaram teste positivo.
Obtenção do antígeno de Leishmania. Para o teste intradérmico do grupo I e a avaliação da resposta imune in vitro, utilizou-se o antígeno solúvel de Leishmania preparado a partir de uma cepa previamente caracterizada por anticorpos monoclonais e isoenzimas como L. amazonensis (MHOMBr88-Ba125).Resumidamente, promastigotas em cultura foram lavadas com PBS pH 7,2 e rompidas pelo choque térmico e sonicação. Após centrifugação, o sobrenadante foi coletado e a concentração de proteínas medida pelo método de Lowry et al18. Para o teste intradérmico utilizou-se o antígeno na concentração de 250µg por ml em solução de PBS pH 7,2 com fenol a 0,4%.
Para o teste intradérmico no grupo II, foi utilizado antígeno total particulado de promastigotas da cepa PH8 de L. amazonensis (cepa de referência pela OMS) produzido por Biomanguinhos-FIOCRUZ, através de fracionamento subcelular por sonicação e choque térmico. O antígeno é preservado em solução de salina mertiolatada 1:10000, na concentração de 40µg de N protéico por ml25, o equivalente a uma concentração de proteína de 250µg por ml.
Reação de Montenegro. Foi administrado 0,1ml do antígeno de Leishmania a 3cm da dobra cubital no antebraço dos indivíduos estudados, sendo a induração mensurada após 48 horas. A leitura foi realizada pela técnica de Sokal JE e cols39, e o teste considerado positivo quando a induração foi maior ou igual a 5mm. Os testes foram realizados em todos os indivíduos por ocasião da inclusão no estudo (dia 0), no dia 30, e repetido no dia 90 quando permanecia negativo.
Cultura de células mononucleares e produção de y-IFN. A produção de y–IFN foi avaliada no dia 0, e 30 e 360 dias após o primeiro teste de Montenegro. As células mononucleares do sangue periférico (CMSP) foram obtidas através do gradiente de Ficoll-Hypaque (LMS; Organon Teknika corporation, Durham,NC). Resumidamente, CMSP (3 X 106/ml) em meio de cultura RPMI completo foram estimuladas com antígenos de Leishmania (10µg/ml) ou com o mitógeno PHA na diluição de 1:100. Após 72 horas de incubação a uma temperatura de 37ºC e 5% CO2, os sobrenadantes foram colhidos e os níveis de y–IFN determinados através da técnica de ELISA sanduíche. Os resultados foram expressos em pg/ml baseados em uma curva padrão.
Análise estatística. As diferenças dos resultados dos testes de Montenegro entre os dias zero, 30 e 90, e as diferenças na proporção de indivíduos que produziram y-IFN nos dias 30 e 360, comparado ao dia zero, foram analisadas através do teste exato de Fisher, enquanto que as diferenças entre os níveis de y-IFN dos dias zero com os dias 30 e 360 foram analisadas utilizando-se o teste Wilcoxon pareado.
RESULTADOS
O resultado dos testes de Montenegro, realizados no início do estudo, 30 e 90 dias após a primeira avaliação são mostrados na Tabela 1. Foi observado que no prazo de 30 dias, 3 dos 9 indivíduos (33%) que utilizaram o antígeno solúvel (grupo I) e 5 dos 12 (42%) que utilizaram o antígeno particulado (grupo II) converteram o teste para positivo. Uma terceira avaliação mostrou que após 90 dias da realização do teste intradérmico inicial, houve conversão do teste em mais 3 dos 9 indivíduos do grupo I e em mais 1 dos 12 do grupo II, ficando a positividade do teste em 67 e 50% para os grupos I e II, respectivamente. A diferença de positividade do Montenegro entre os dias 0 e 90 foi estatisticamente significante tanto para o grupo I quanto para o grupo II (p< 0,05).
As concentrações de y–IFN nos sobrenadantes de culturas estimuladas com antígeno de Leishmania são mostradas na Figura 1. No dia 30 após a realização do teste intradérmico, 7 (33%) dos 21 indivíduos testados passaram a produzir y–IFN, sendo a média da produção nesses 7 indivíduos de 235 ± 329pg/ml. Enquanto y–IFN não foi detectado em nenhum dos indivíduos na avaliação do dia zero, no dia 30 esta citocina foi detectada em 5 dos 9 indivíduos do grupo I (p< 0,05), com concentração média de 169 ± 309 pg/ml (níveis variando entre 12 e 901pg/ml) e em dois dos 12 indivíduos do grupo II, com média de 11 ± 36 pg/ml (níveis de 5 e 122pg/ml). Após 30 dias da realização do primeiro teste intradérmico, 7 (78%) de 9 indivíduos do grupo I e 6 (50%) de 12 indivíduos do grupo II mostravam resposta imunológica para antígeno de Leishmania, definida por uma positividade do teste de Montenegro e/ou produção de y–IFN em sobrenadantes de cultura.
A presença de y–IFN foi observada mesmo após 360 dias do primeiro teste em 13 de 18 indivíduos avaliados (72%), sendo a média e desvio padrão da produção de y–IFN de 44 ± 79pg/ml. Seis destes 13 indivíduos que produziram y–IFN no dia 360 já produziam esta citocina no dia 30 após o primeiro teste intradérmico. Na avaliação do dia 360, y–IFN foi detectado em seis dos nove indivíduos do grupo I que não produziram esta citocina na avaliação do dia zero (p< 0,05), com média de produção significativamente maior do a observada na avaliação inicial (p< 0,05) (69 ± 108pg/ml, níveis variando entre 14 e 258pg/ml). Enquanto a produção de y–IFN não foi também observada em indivíduos do grupo II na avaliação inicial, no dia 360 esta citocina foi detectada em sete indivíduos (p< 0,05), com média de produção de 18 ± 20pg/ml (níveis variando entre 4 e 57pg/ml) (Figura 1). Em todos os indivíduos observou-se produção de y–IFN em culturas estimuladas com PHA (dado não mostrado).
DISCUSSÃO
O teste de hipersensibilidade tardia utilizando antígeno de Leishmania preconizado por Montenegro é um importante método para diagnóstico da leishmaniose tegumentar e é amplamente empregado em estudos epidemiológicos para a identificação de indivíduos expostos e sem doença e indivíduos curados de infecção causada pela Leishmania. O teste, entretanto, não é padronizado e vários preparados antigênicos em diferentes doses são descritos8 32. Por esta razão, a avaliação do poder imunizante da reação de Montenegro, no presente estudo, foi realizada utilizando-se dois tipos de preparado antigênico correntemente empregados em estudos clínicos e epidemiológicos. Apesar das diferenças na preparação e nos conservantes utilizados, ambos os reagentes, quando aplicados na mesma dosagem, tiveram a capacidade de induzir resposta imune, in vitro e in vivo, ao antígeno de Leishmania.
O fenômeno de indução de hipersensibilidade tardia por repetição dos testes intradérmicos, em indivíduos sadios, é um assunto controverso na literatura. Enquanto Keystone et al15 verificaram que cerca de 40% dos indivíduos avaliados apresentavam hipersensibilidade tardia após 6 semanas de exposição aos antígenos PPD, estreptoquinase, estreptodornase, Candida e da caxumba; Lesourd et al17 não observaram sensibilização do sistema imune nessas circunstâncias. Em relação ao antígeno de Leishmania parece ter relevância o intervalo de tempo entre a realização dos testes. Quando este intervalo foi de duas semanas, a positividade do 2º teste ocorreu em mais de 60% dos indivíduos avaliados29, enquanto que não foi observado positividade do teste intradérmico quando o intervalo foi maior ou igual a um ano40.
Estudos prévios têm mostrado que células mononucleares de indivíduos sadios não expostos a Leishmania podem apresentar resposta linfoproliferativa e produção de y–IFN in vitro quando estimulados por antígenos desse parasita3 19 14 16. Este fenômeno pode ser explicado pela existência de reação cruzada, uma vez que epitopos presentes na Leishmaniasão documentadas em outros patógenos como Mycobacterium bovis e Trypanosoma cruzi38. Neste caso, poderia haver um número limitado de clones de células sensibilizadas que se expandiriam em contato com os antígenos de Leishmania. Embora não se possa afastar que reações cruzadas contribuam para explicar a conversão do teste do Montenegro após uma 2ª administração do antígeno, a observação neste estudo de que, na avaliação inicial não havia produção de y–IFN quando as células foram estimuladas, in vitro, com antígeno de Leishmania, aponta para a uma real capacidade destes antígenos serem imunogênicos. Deve-se ressaltar que os conservantes fenol e mertiolate poderiam interferir na leitura do teste intradérmico, mas a reação induzida por essas substâncias é, habitualmente, de hipersensibilidade imediata e este fenômeno também não explicaria a produção de citocinas in vitro.
O teste de Montenegro tem sido, ainda, aplicado como um marcador de resposta imune e da proteção contra a leishmaniose em indivíduos vacinados com antígeno bruto de Leishmania4 5 22 23 24 28. Como a proteção induzida por esta vacina ainda não foi comprovada e estudos com vacinas mostraram que a taxa de conversão do teste foi semelhante nos indivíduos vacinados e controles7 34, a utilização da reação de hipersensibilidade tardia como marcador da indução de resposta imune deve ser vista com cautela quando este teste é realizado previamente à administração da vacina. Recentemente, Marzochi et al21, encontraram uma taxa de conversão do teste de Montenegro de aproximadamente 66%, tanto em indivíduos vacinados como no grupo controle. O conhecimento da produção de y–IFN induzida pelo teste de Montenegro também se reveste de grande importância, uma vez que a presença desta citocina vinha sendo relacionada com o poder imunizante da vacina em estudos onde a população era selecionada pela prévia realização do teste de Montenegro e, então, vacinadas para LTA. As observações do presente estudo apontam para a necessidade de uma melhor padronização das soluções de antígenos de Leishmania utilizadas para a realização desse teste intradérmico, e que devido a sua capacidade imunogênica ele não deve ser utilizado previamente ao uso de vacinas contra a LTA.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem aos voluntários que participaram do estudo, a Virgínia Avelar pela preparação do antígeno de Leishmania, e a Dilma Simplício e Clenildo Bispo pelo auxílio técnico. Este estudo recebeu apoio financeiro do NIH AI 30639 e do Programa de Apoio aos Núcleos de Excelência (PRONEX).
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